基因组范围内鉴定梨环核苷酸门控通道的基因家族以及进化与表达分析
环核苷酸门控通道（CNGC）是在动植物细胞中普遍存在的离子通道基因家族，植物CNGC参与调控植物的生长发育过程。本文通过系统发育树分析、染色体定位分析、结构分析和域分析等鉴定了梨CNGC基因家族，并与已经存在的拟南芥CNGC家族进行比较，探明了梨CNGC基因详细的进化和表达特性。本研究鉴定梨花粉质膜上的钙离子通道CNGC以及其功能调控分析，为梨花粉管生长的各种生理生化反应提供研究基础。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1□材料与方法2
1.1□候选梨CNGC基因收集2
1.2□CNGC基因家族的序列分析与系统发育分析2
1.3□CNGC基因的染色体定位与基因结构2
1.4□CNGC基因的扩张模式分析2
2□结果与分析3
2.1□梨环核苷酸门控通道（CNGC）基因家族3
2.1．1□梨CNGC基因家族3
2.1．2□系统发育树分析3
2.1.3□染色体定位分析5
2.1.4□外显子/内含子结构分析6
2.2□梨CNGC基因家族的域分析6
2.2.1□S4分析6
2.2.2□S6分析6
2.2.2□CaMBD分析9
2.3□梨与拟南芥中环核苷酸门控通道（CNGC）基因家族的进化方式10
3□结论12
致谢12
参考文献12
基因组范围内鉴定梨环核苷酸门控通道的基因家族以及进化与表达分析
引言
引言 植物像任何其他生物一样需要营养才能够生存和生长，现已经知道植物必须得离子有16种[1,2],并且在进化过程中，形成了包括离子通道、离子泵和载体的复杂的营养吸收和转运系统。通过电生理学和分子生物学技术，人们已经确定了这些转运系统的存在，且有许多转运蛋白已经在基因水平上得到确认。转运蛋白在表达其功能是受细胞内外不同因子的调控，表现出信号转导和代谢调节的作用，在生长发育过程中起到调节作用。其中，植物环核苷酸门控通道家族（CNGCs）进化为一个非选择性 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
的阳离子通道，它的具体结构与功能与Shaker型钾离子电压门控通道相似[3]。
CNGC基因家族普遍存在于动植物中，首先在动物的视网膜感光细胞质膜中发现[4]，由此拉开了人们研究CNGC的序幕。人们也已经在拟南芥、大麦、水稻、玉米等许多植物中发现了CNGC的存在。但是，仍然没有关于木本植物（例如梨）的CNGC基因家族分析的报道。最近梨的基因组序列绘制成功，给我们提供了很好的机会去研究CNGC基因家族在这个物种上的鉴定和调控功能分析。通过与拟南芥CNGC基因家族的比较，我们能更好的了解梨中CNGC的基因家族成员以及成员基因之间的进化分析。
1 材料与方法
1．1 候选梨CNGC基因序列收集
为了鉴定分析梨CNGC基因家族，我们对多个数据库进行搜索。首先在网站（http://www.arabidopsis.org）上获得拟南芥基因序列（http://www.arabidopsis.org），并用BLAST在梨基因组数据库（Peargenome.njau.edu.cn）中搜索重复基因序列，从而得到梨的CNGC基因。在梨基因数据库中搜索关键词“环核苷酸门控离子通道”或者“CNGC”，将所得的结果运用MEGA 4.1软件使用默认参数进行多重序列比对。然后运用PFAM（http://pfam.sanger.ac.uk/）和SMART（http://smart.emblheidelberg.de/）结合默认参数对候选梨CNGC基因进行域分析，鉴定结果表明梨CNGC基因上拥有六个跨膜区域、孔区、环核苷酸结合域（CNBD）以及钙调素结合域（CaMBD）或异亮氨酸谷氨酰胺域（IQD），并根据基因注释以及编码序列最终确定PbrCNGC的假基因。
CNGC基因家族的序列分析与系统发育分析
运用软件Clustal X将CNGC基因的整个氨基酸序列进行比对，为了证实Clustal X输出结果的准确性，进一步用软件MUSCLE （版本 3.52 ；http://muscle.sourcearchive.com/）进行多序列比对。采用软件MEGA4.1 (http://www.megasoftware.net/)中的最大似然（ML）法构建CNGC基因的蛋白质序列的系统发育树，为了确保准确性，我们进行1000次的bootstraps重复。所获得的系统发育树图像是用Adobe Fireworks CS4软件绘制的。
CNGC基因的染色体定位与基因结构
为了确定CNGC基因的实际位置，使用BlastN对梨和拟南芥的基因组搜索全部的核苷酸序列，得到每条染色体上CNGC基因的起始位置。然后，用MapInspect软件绘制梨和拟南芥CNGC基因在染色体上的位置图像（http://www.plantbreeding.wur.nl/uk/software_mapinspect.html）。梨和拟南芥外含子/内含子的结构信息可从网站（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/）上获得。
CNGC基因的扩张模式分析
基因家族的扩张模式是由片段复制、串联复制和随机复制所决定的的。因为随机复制在基因序列分析中很难识别，所以我们着重研究片段复制和串联复制的过程。为了对CNGC基因家族的扩张进行分类，我们找到梨和拟南芥中所有基因在染色体上的位置。以多个基因串联复制为特征的CNGC基因都处于同一或者相邻的区域，我们用一种与Maher等人相似的方法来确定片段，首先，收集系统发育树上CNGC基因旁系同源基因的终端节点，然后，将10对旁系同源基因每一对的上端与下端都与已经被命名的梨和拟南芥CNGC基因进行比对，最后，利用上述方法确定CNGC基因的复制模型。如果一对基因同时在基因的编码蛋白保守区，则认为这对基因来自于同一个重复事件。
2 结果与分析
2．1 梨环核苷酸门控通道（CNGC）基因家族
2．1．1 梨CNGC基因家族
最近梨的基因序列发布，为确定梨CNGC基因家族[5]，我们通过对比拟南芥CNGC基因序列信息对多个DNA数据库搜索关键词“环核苷酸离子通道”、“蛋白质结构域”找出了27个基因序列。然后进一步运用PFAM和SMART将所获得的编码序列进行注释，结果表明，27个基因中包括2个假基因以及4个同时没用钙调素结构域（CaMBD）和异亮氨酸谷氨酰胺域（IQD）的基因碎片，排除这六个基因，对另外21个基因进行命名（Table 1）。这个数量类似于拟南芥CNGC基因家族的数量（20个）。这21个梨CNGC基因都具有CNGC家族的保守区域，既包括六个跨膜区域，孔区、环核苷酸结合域（CNBD）、钙调素结合域（CaMBD）或N端的异亮氨酸谷氨酰胺域（IQD）（Fig.1）。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1□材料与方法2
1.1□候选梨CNGC基因收集2
1.2□CNGC基因家族的序列分析与系统发育分析2
1.3□CNGC基因的染色体定位与基因结构2
1.4□CNGC基因的扩张模式分析2
2□结果与分析3
2.1□梨环核苷酸门控通道（CNGC）基因家族3
2.1．1□梨CNGC基因家族3
2.1．2□系统发育树分析3
2.1.3□染色体定位分析5
2.1.4□外显子/内含子结构分析6
2.2□梨CNGC基因家族的域分析6
2.2.1□S4分析6
2.2.2□S6分析6
2.2.2□CaMBD分析9
2.3□梨与拟南芥中环核苷酸门控通道（CNGC）基因家族的进化方式10
3□结论12
致谢12
参考文献12
基因组范围内鉴定梨环核苷酸门控通道的基因家族以及进化与表达分析
引言
引言 植物像任何其他生物一样需要营养才能够生存和生长，现已经知道植物必须得离子有16种[1,2],并且在进化过程中，形成了包括离子通道、离子泵和载体的复杂的营养吸收和转运系统。通过电生理学和分子生物学技术，人们已经确定了这些转运系统的存在，且有许多转运蛋白已经在基因水平上得到确认。转运蛋白在表达其功能是受细胞内外不同因子的调控，表现出信号转导和代谢调节的作用，在生长发育过程中起到调节作用。其中，植物环核苷酸门控通道家族（CNGCs）进化为一个非选择性 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
的阳离子通道，它的具体结构与功能与Shaker型钾离子电压门控通道相似[3]。
CNGC基因家族普遍存在于动植物中，首先在动物的视网膜感光细胞质膜中发现[4]，由此拉开了人们研究CNGC的序幕。人们也已经在拟南芥、大麦、水稻、玉米等许多植物中发现了CNGC的存在。但是，仍然没有关于木本植物（例如梨）的CNGC基因家族分析的报道。最近梨的基因组序列绘制成功，给我们提供了很好的机会去研究CNGC基因家族在这个物种上的鉴定和调控功能分析。通过与拟南芥CNGC基因家族的比较，我们能更好的了解梨中CNGC的基因家族成员以及成员基因之间的进化分析。
1 材料与方法
1．1 候选梨CNGC基因序列收集
为了鉴定分析梨CNGC基因家族，我们对多个数据库进行搜索。首先在网站（http://www.arabidopsis.org）上获得拟南芥基因序列（http://www.arabidopsis.org），并用BLAST在梨基因组数据库（Peargenome.njau.edu.cn）中搜索重复基因序列，从而得到梨的CNGC基因。在梨基因数据库中搜索关键词“环核苷酸门控离子通道”或者“CNGC”，将所得的结果运用MEGA 4.1软件使用默认参数进行多重序列比对。然后运用PFAM（http://pfam.sanger.ac.uk/）和SMART（http://smart.emblheidelberg.de/）结合默认参数对候选梨CNGC基因进行域分析，鉴定结果表明梨CNGC基因上拥有六个跨膜区域、孔区、环核苷酸结合域（CNBD）以及钙调素结合域（CaMBD）或异亮氨酸谷氨酰胺域（IQD），并根据基因注释以及编码序列最终确定PbrCNGC的假基因。
CNGC基因家族的序列分析与系统发育分析
运用软件Clustal X将CNGC基因的整个氨基酸序列进行比对，为了证实Clustal X输出结果的准确性，进一步用软件MUSCLE （版本 3.52 ；http://muscle.sourcearchive.com/）进行多序列比对。采用软件MEGA4.1 (http://www.megasoftware.net/)中的最大似然（ML）法构建CNGC基因的蛋白质序列的系统发育树，为了确保准确性，我们进行1000次的bootstraps重复。所获得的系统发育树图像是用Adobe Fireworks CS4软件绘制的。
CNGC基因的染色体定位与基因结构
为了确定CNGC基因的实际位置，使用BlastN对梨和拟南芥的基因组搜索全部的核苷酸序列，得到每条染色体上CNGC基因的起始位置。然后，用MapInspect软件绘制梨和拟南芥CNGC基因在染色体上的位置图像（http://www.plantbreeding.wur.nl/uk/software_mapinspect.html）。梨和拟南芥外含子/内含子的结构信息可从网站（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/）上获得。
CNGC基因的扩张模式分析
基因家族的扩张模式是由片段复制、串联复制和随机复制所决定的的。因为随机复制在基因序列分析中很难识别，所以我们着重研究片段复制和串联复制的过程。为了对CNGC基因家族的扩张进行分类，我们找到梨和拟南芥中所有基因在染色体上的位置。以多个基因串联复制为特征的CNGC基因都处于同一或者相邻的区域，我们用一种与Maher等人相似的方法来确定片段，首先，收集系统发育树上CNGC基因旁系同源基因的终端节点，然后，将10对旁系同源基因每一对的上端与下端都与已经被命名的梨和拟南芥CNGC基因进行比对，最后，利用上述方法确定CNGC基因的复制模型。如果一对基因同时在基因的编码蛋白保守区，则认为这对基因来自于同一个重复事件。
2 结果与分析
2．1 梨环核苷酸门控通道（CNGC）基因家族
2．1．1 梨CNGC基因家族
最近梨的基因序列发布，为确定梨CNGC基因家族[5]，我们通过对比拟南芥CNGC基因序列信息对多个DNA数据库搜索关键词“环核苷酸离子通道”、“蛋白质结构域”找出了27个基因序列。然后进一步运用PFAM和SMART将所获得的编码序列进行注释，结果表明，27个基因中包括2个假基因以及4个同时没用钙调素结构域（CaMBD）和异亮氨酸谷氨酰胺域（IQD）的基因碎片，排除这六个基因，对另外21个基因进行命名（Table 1）。这个数量类似于拟南芥CNGC基因家族的数量（20个）。这21个梨CNGC基因都具有CNGC家族的保守区域，既包括六个跨膜区域，孔区、环核苷酸结合域（CNBD）、钙调素结合域（CaMBD）或N端的异亮氨酸谷氨酰胺域（IQD）（Fig.1）。
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