5个夏菊品种再生体系的建立
以5个菊花品种‘四季菊’、‘夏黄’、‘白秀芳’、‘夏白’、‘八海’无菌苗的幼嫩叶片为材料，建立了5个品种的再生体系。以MS为基本培养基添加不同浓度的6-BA和NAA，通过一定时间诱导，幼嫩叶片可以通过愈伤产生不定芽，但基因型不同，愈伤诱导率和分化率也不同。结果表明，‘四季菊’的最适愈伤诱导和分化培养基为MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.5mg /L；‘夏黄’和‘白秀芳’的最适愈伤诱导培养基为MS+6-BA2.0mg /L+NAA0.5mg /L，分化培养基为: MS+6-BA3.0mg /L+NAA0.5mg /L；‘夏白’的最适愈伤诱导和分化培养基为: MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.5mg /L；‘八海’的最适愈伤诱导培养基为MS+6-BA 1.0mg/L+NAA0.5mg /L，分化培养基为: MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L。这为研究夏菊分子育种奠定了良好基础。
目录
摘要3
关键词3
Abstract 3
Keywords3引言4
1 材料与方法4
1.1 植物材料4
1.2 培养条件5
1.3 研究方法5
1.3.1 无菌苗的获得5
1.3.2 培养基配制5
1.3.3不定芽的分化5
1.3.4生根和移栽5
2．结果与分析 5
2.1 愈伤组织的诱导5
2.2 不定芽的诱导6
2.3 根的诱导8
3．讨论 8
致谢8
参考文献9
附录C本科生毕业论文（设计）答辩及综合评分表 12
表1 不同植物生长调节剂组合对菊花叶片愈伤组织诱导的影响6
表2 不同生长调节剂组合对菊花叶片不定芽再生的影响7
表3 5种夏菊在MS培养下的生根情况8
5个夏菊品种再生体系的建立
引言
引言
菊花(Chrysanthemum morifolim (Runat) Tzvel. )原产中国，是世界重要盆栽、切花及地被花卉。多年来利用常规杂交、辐射诱变等技术在菊花育 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
种上取得了巨大的成就[1]。随着基因分离克隆、基因载体构建、植物遗传转化等技术体系的完善和如何实现外源基因在植物细胞中高效表达等方面的深入研究，使转基因手段得以在植物育种中广泛运用。利用遗传转化技术可定向修饰菊花的某些目标状并保留原有性状，使其在花色、花期、抗病性、抗虫性等方面发挥重要作用。而成功的基因转化首先依赖于良好的菊花再生体系的建立，即要求较高的再生频率和分化率，且具稳定性、重复性。由于菊花的资源有限，采用传统的杂交育种方法很难获得高抗或耐低温的优良品种；远缘杂交育种存在着一定的生殖隔离。虽然通过自发突变、杂交和其它传统的育种方法产生了一些重要的品种，但是传统方法所能提供的基因库是有限的，而植物基因工程则可以将其它生物如细菌、病毒和其它植物的外源基因导入到观赏植物中,以此改变园艺品种的观赏特性。据文献报道，菊花的再生受到基因型的限制，再生体系没有普遍性，有些品种再生不稳定[1]。成功的基因转化首先依赖于良好的植物受体系统的建立,其中外植体的选择以及能产生高再生能力的培养体系的确立是转化体系建立的关键。自Hill1968年利用芽尖通过愈伤组织诱导成株建立菊花的再生体系以来,有大量以叶柄[2]、叶片[24,913]、茎(节间) [5,6,12]、管状花[7]、花梗[8]等为外植体建立菊花再生体系的报道,并相继报道菊花亦可以通过原生质体培养和体细胞胚培养分化成株[8].大量研究也表明,菊花不同基因型的再生能力和再生条件存在较大差异.
菊花的营养生长和开花有着显着的季节性差异，延长其生长和开花依赖温度和光照时间的组合。Sumitomo和Li对于4个菊花品种的研究表明，温度的差异对菊花开花有着更为显著的影响。在他们的研究中，低温处理可促使菊花早花，而同时施加外源赤霉素处理，可回复这一现象，促进营养生长，延缓开花时间。在拟南芥开花时间调控网络中FLC基因是一个关键决定因子，FLC的表达对开花起抑制作用，是拟南芥开花时间自然变异的主要因素之一。FLC主要通过表达水平的变化调控拟南芥成花转化的进程，自主促进途径和春化途径中有许多开花时间调控基因的功能都是通过调节FLC的表达水平来实现的。春化作用主要是引起开花抑制基因FLC处于关闭状态，以解除对开花激活子FT 和SOC1的抑制，FLC功能缺失突变体表型为早花，而FLC的过表达则会延迟开花，表明有活性的FLC是开花抑制物，FLC mRNA或FLC蛋白水平与开花时间具有高度一致性，FLC的表达水平低则表现为早花，FLC的表达水平高则表现为晚花[16]。
夏菊与秋菊不同，夏菊是量性短日照植物, 同时也是一种春化型植物，一定时间的低温处理能够促进夏菊开花。本研究挑选越冬后开花的5个夏菊品种，分别以茎、叶盘为外植体进行培养，以6BA，NAA为生长调节物质进行离体培养研究, 建立快速分化的再生体系，为探究低温影响FLC的表达以调控菊花开花时间的分子机制和分子育种奠定基础。
1 材料与方法
1．1植物材料
供试材料为大学‘中国菊花品种资源保存中心’保存的5个夏菊品种：‘四季菊’、‘夏黄’、‘白秀芳’、‘夏白’、‘八海’。
1．2培养条件
本试验所用培养基均以MS为基本培养基，蔗糖30g/L，琼脂6.0g/L，pH值用NaOH调节到5.8, 121℃高压灭菌15min。分化培养基附加(1)6BA1.0mg/L+NAA0.5mg/ L；(2)6BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L；(3)6BA3.0mg/L+NAA0.5mg/L。增殖培养基为(1)(2)(3)；生根培养基为MS。培养温度为25±2℃，日光灯光源，光照(3236 μmolm2s1)16h/d。每培养皿1030个外植体，至少重复3次。
1.3 研究方法
1.3.1无菌苗的获得
将菊花基地采摘的5个菊花品种的带腋芽茎段在用自来水冲洗半个小时，用滤纸吸干后，于超净工作台上用75%的酒精浸泡30 s，再转移到0.1%的升汞中洗涤35 min，取出，用无菌水冲洗56次，每次不少于3 min。经消毒灭菌后的菊花茎段剪成小段，每段长23 cm，带有12腋芽，接种于MS培养基中，每个组培瓶12棵。23天后，逐步剔除内生菌污染的瓶苗。20 d后，外植体的茎段上的叶腋长出不定芽，不定芽长至8 cm左右时，再剪成2 cm左右，并含有至少一个叶芽的茎段接种于MS培养基上，经过快速繁殖后形成的无菌苗用于叶盘不定芽再生。
1.3.2培养基配制
以MS为基本培养基,蔗糖30 g/L,琼脂6.0 g/L,根据外植体不同培养阶段对植物生长调节剂的不同要求,设计了3种不同激素的组合和配比。其中分化培养基附加 (1)6BA1.0mg/L+NAA0.5mg/；(2)6BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L；(3)6BA3.0mg/L+NAA0.5mg/L；pH值为5.8,121℃高压灭菌21min。
1.3.3不定芽的分化
从新增殖(3周左右)的幼苗上切取叶盘约0.5 cm2，近轴面用镊子尖端轻微刺伤 ,并以近轴面接触分化培养基;茎段(节间)35 mm，横放在分化培养基上。每3周继代1次。
1.3.4 生根和移栽
目录
摘要3
关键词3
Abstract 3
Keywords3引言4
1 材料与方法4
1.1 植物材料4
1.2 培养条件5
1.3 研究方法5
1.3.1 无菌苗的获得5
1.3.2 培养基配制5
1.3.3不定芽的分化5
1.3.4生根和移栽5
2．结果与分析 5
2.1 愈伤组织的诱导5
2.2 不定芽的诱导6
2.3 根的诱导8
3．讨论 8
致谢8
参考文献9
附录C本科生毕业论文（设计）答辩及综合评分表 12
表1 不同植物生长调节剂组合对菊花叶片愈伤组织诱导的影响6
表2 不同生长调节剂组合对菊花叶片不定芽再生的影响7
表3 5种夏菊在MS培养下的生根情况8
5个夏菊品种再生体系的建立
引言
引言
菊花(Chrysanthemum morifolim (Runat) Tzvel. )原产中国，是世界重要盆栽、切花及地被花卉。多年来利用常规杂交、辐射诱变等技术在菊花育 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
种上取得了巨大的成就[1]。随着基因分离克隆、基因载体构建、植物遗传转化等技术体系的完善和如何实现外源基因在植物细胞中高效表达等方面的深入研究，使转基因手段得以在植物育种中广泛运用。利用遗传转化技术可定向修饰菊花的某些目标状并保留原有性状，使其在花色、花期、抗病性、抗虫性等方面发挥重要作用。而成功的基因转化首先依赖于良好的菊花再生体系的建立，即要求较高的再生频率和分化率，且具稳定性、重复性。由于菊花的资源有限，采用传统的杂交育种方法很难获得高抗或耐低温的优良品种；远缘杂交育种存在着一定的生殖隔离。虽然通过自发突变、杂交和其它传统的育种方法产生了一些重要的品种，但是传统方法所能提供的基因库是有限的，而植物基因工程则可以将其它生物如细菌、病毒和其它植物的外源基因导入到观赏植物中,以此改变园艺品种的观赏特性。据文献报道，菊花的再生受到基因型的限制，再生体系没有普遍性，有些品种再生不稳定[1]。成功的基因转化首先依赖于良好的植物受体系统的建立,其中外植体的选择以及能产生高再生能力的培养体系的确立是转化体系建立的关键。自Hill1968年利用芽尖通过愈伤组织诱导成株建立菊花的再生体系以来,有大量以叶柄[2]、叶片[24,913]、茎(节间) [5,6,12]、管状花[7]、花梗[8]等为外植体建立菊花再生体系的报道,并相继报道菊花亦可以通过原生质体培养和体细胞胚培养分化成株[8].大量研究也表明,菊花不同基因型的再生能力和再生条件存在较大差异.
菊花的营养生长和开花有着显着的季节性差异，延长其生长和开花依赖温度和光照时间的组合。Sumitomo和Li对于4个菊花品种的研究表明，温度的差异对菊花开花有着更为显著的影响。在他们的研究中，低温处理可促使菊花早花，而同时施加外源赤霉素处理，可回复这一现象，促进营养生长，延缓开花时间。在拟南芥开花时间调控网络中FLC基因是一个关键决定因子，FLC的表达对开花起抑制作用，是拟南芥开花时间自然变异的主要因素之一。FLC主要通过表达水平的变化调控拟南芥成花转化的进程，自主促进途径和春化途径中有许多开花时间调控基因的功能都是通过调节FLC的表达水平来实现的。春化作用主要是引起开花抑制基因FLC处于关闭状态，以解除对开花激活子FT 和SOC1的抑制，FLC功能缺失突变体表型为早花，而FLC的过表达则会延迟开花，表明有活性的FLC是开花抑制物，FLC mRNA或FLC蛋白水平与开花时间具有高度一致性，FLC的表达水平低则表现为早花，FLC的表达水平高则表现为晚花[16]。
夏菊与秋菊不同，夏菊是量性短日照植物, 同时也是一种春化型植物，一定时间的低温处理能够促进夏菊开花。本研究挑选越冬后开花的5个夏菊品种，分别以茎、叶盘为外植体进行培养，以6BA，NAA为生长调节物质进行离体培养研究, 建立快速分化的再生体系，为探究低温影响FLC的表达以调控菊花开花时间的分子机制和分子育种奠定基础。
1 材料与方法
1．1植物材料
供试材料为大学‘中国菊花品种资源保存中心’保存的5个夏菊品种：‘四季菊’、‘夏黄’、‘白秀芳’、‘夏白’、‘八海’。
1．2培养条件
本试验所用培养基均以MS为基本培养基，蔗糖30g/L，琼脂6.0g/L，pH值用NaOH调节到5.8, 121℃高压灭菌15min。分化培养基附加(1)6BA1.0mg/L+NAA0.5mg/ L；(2)6BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L；(3)6BA3.0mg/L+NAA0.5mg/L。增殖培养基为(1)(2)(3)；生根培养基为MS。培养温度为25±2℃，日光灯光源，光照(3236 μmolm2s1)16h/d。每培养皿1030个外植体，至少重复3次。
1.3 研究方法
1.3.1无菌苗的获得
将菊花基地采摘的5个菊花品种的带腋芽茎段在用自来水冲洗半个小时，用滤纸吸干后，于超净工作台上用75%的酒精浸泡30 s，再转移到0.1%的升汞中洗涤35 min，取出，用无菌水冲洗56次，每次不少于3 min。经消毒灭菌后的菊花茎段剪成小段，每段长23 cm，带有12腋芽，接种于MS培养基中，每个组培瓶12棵。23天后，逐步剔除内生菌污染的瓶苗。20 d后，外植体的茎段上的叶腋长出不定芽，不定芽长至8 cm左右时，再剪成2 cm左右，并含有至少一个叶芽的茎段接种于MS培养基上，经过快速繁殖后形成的无菌苗用于叶盘不定芽再生。
1.3.2培养基配制
以MS为基本培养基,蔗糖30 g/L,琼脂6.0 g/L,根据外植体不同培养阶段对植物生长调节剂的不同要求,设计了3种不同激素的组合和配比。其中分化培养基附加 (1)6BA1.0mg/L+NAA0.5mg/；(2)6BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L；(3)6BA3.0mg/L+NAA0.5mg/L；pH值为5.8,121℃高压灭菌21min。
1.3.3不定芽的分化
从新增殖(3周左右)的幼苗上切取叶盘约0.5 cm2，近轴面用镊子尖端轻微刺伤 ,并以近轴面接触分化培养基;茎段(节间)35 mm，横放在分化培养基上。每3周继代1次。
1.3.4 生根和移栽
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