rnaset2诱导梨花粉管死亡的毒理学分析
摘要：S-RNase是配子体型自交不亲和性的雌蕊决定因子，其进入不亲和花粉管后降解花粉RNA，抑制花粉管生长，在自交不亲和性反应中起重要作用。在烟草中研究表明，S-RNase的活性对酸碱度敏感，但是梨花柱S-RNase活性对酸碱度的响应还不清楚。本研究以‘砀山酥梨’为试验对象，通过离子交换方法在花柱中提取出高纯度S-RNase，利用柠檬酸、乙酸协同S-RNase处理不亲和花粉，探讨其毒理强弱对酸碱度的敏感性。结果表明添加柠檬酸、乙酸后，花柱S-RNase活力发生了显著变化，花粉萌发率比未添加柠檬酸、乙酸的培养基降低了60%-70%。通过花柱S-RNase活力鉴定发现，当柠檬酸、乙酸的浓度增加时，花柱S-RNase的相对活性也随之上升。因此本研究认为柠檬酸和乙酸能够通过调整酸度增强S-RNase对自花花粉管的毒性。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 实验材料 2
1.2 实验方法 2
1.2.1 花柱SRNase的提取2
1.2.2 SDS 蛋白质凝胶电泳3
1.2.3 花粉离体培养3
1.2.4 梨花柱SRNase活力测定3
2 结果与分析3
2.1 SDS蛋白凝胶电泳结果3
2.2 梯度浓度酸性物质处理后花粉管生长情况4
2.2.1 不同浓度柠檬酸处理后梨花粉管生长情况4
2.2.2 不同浓度乙酸处理后梨花粉管生长情况5
2.3 酸性物质对SRNase活性的影响6
2.3.1 柠檬酸对SRNase活性的影响6
2.3.2 乙酸对SRNase活性的影响7
2.4 SRNase蛋白活力测定 8
3 讨论 8
致谢9
参考文献9
RNase T2诱导梨花粉管死亡的毒理学分析
引言
自交不亲和性（Selfincompatibility，SI）是显花植物雌蕊的花柱或柱头可以识别自体花粉或S基因
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
型相同的异体花粉，并抑制其萌发或生长的一种特性。自交不亲和使自体受精不能实现，只有遗传组成不相同的异体花粉才能完成受精，是显花植物防止近亲繁殖、促进异交和保持遗传变异的一种特性，也是植物物种多样性的一个诱因。根据遗传控制方式，植物自交不亲和性可分为孢子体型自交不亲和性（Sporophytic selfincompatibility，SSI）和配子体型自交不亲和性（Gametophytic selfincompatibility，GSI）。孢子体型自交不亲和性的花粉表型由孢子体（产生花粉的植株）基因型决定，配子体型自交不亲和性的花粉表型由其自身的单倍体S基因型决定，花粉管生长的抑制一般发生在花柱的传递组织中。梨是典型的蔷薇科配子体型自交不亲和植物，当花粉与花柱中相同S基因型特异性表达之后自交不亲和反应就会发生，导致花粉管在花柱中停止生长。
目前，控制配子体型自交不亲和性的雌蕊和花粉决定因子已被确定，分别是SRNase和Fbox基因[1]。特定的S等位基因相关蛋白最早在月见草（Oenothera organesis）中被分离出来[2]。Anderson等在1986年首次克隆出cDNA编码的S等位基因糖蛋白[3]，推导出的氨基酸序列有力地证明了花柱RNase参与了花柱中的识别和抑制反应。另外在茄科植物中，花柱S等位基因的产物是一种序列中含有真菌RNase T2活性位点的糖蛋白[4]，是一种核酸酶，称为S核酸酶（SRNase）[56]。1994年在矮牵牛和烟草中进行的基因改造分析实验证明了在茄科植物中SRNase决定了配子体型自交不亲和性花粉抑制反应的特异性[78]。Sassa和Broothaerts等也分别报道了SRNase参与蔷薇科梨属和苹果属的配子体自交不亲和反应[912]。
核糖核酸酶（Ribonuclease，RNase）的主要功能是催化RNA的水解，它作用于RNA的3,5磷酸二酯键，产物是5磷酸核苷和3磷酸核苷，在生命活动中发挥着重要的调节作用。生物中的核糖核酸酶有RNase T1、RNase T2和RNase A三种。RNase A主要存在于动物中，RNase T1在真菌和细菌中较为常见，RNase T2则分布于原生动物、植物、细菌、动物和病毒中[13]。T2家族核糖核酸酶是转移酶类型的RNA酶，因为他们与米曲霉中的RNase T2具有相似性[1415]，该家族能刺激单链RNA通过23磷酸循环中间体裂解，生成具有3端的单链核苷酸或寡核苷酸。目前提出的RNase T2的生物学功能包括清除核酸、自身RNA的降解以及作为外源或内源细胞毒素等[16]。在茄科中一系列的实验指出，SRNase在花粉管中通过RNase起到了细胞毒素的作用，且SRNase活性在矮牵牛的花粉拒绝反应中是必须的[17]。
目前，关于SRNase导致花粉管死亡的功能研究认为，花柱自我SRNase能进入花粉管内降解花粉管内RNA，导致蛋白质合成受阻，花粉管发生细胞程序性死亡（programmed cell death，PCD）[18]。利用荧光标记、透射电镜和蛋白免疫印迹等技术证实该死亡属于细胞程序性死亡类型[19]。在虞美人花粉自交不亲和的细胞程序性死亡过程中发现了花粉管液泡的酸化，并指出pH降低可能抑制花粉生长所需的可溶性焦磷酸酶和触发自交不亲和性PCD的信号途径[20]。因为大部分RNase T2保持最佳活性的pH值一般维持在45之间，其最适pH的活性与它们在液泡或溶酶体中的位置具有一致性，表明这些核糖核酸酶的功能之一是使带有酸性分层的自身RNA发生降解[16]。因此认为一定酸性条件能够增强SRNase对花粉管的抑制。为验证这一假设，本实验通过不同种类的酸与SRNase同时处理花粉管，进而建立酸与SRNase之间的联系，为SRNase的毒理性研究提供新的证据。
1 材料与方法
1．1 实验材料
用于试验的花粉和花柱为2015年取于大学江浦农场园艺试验站梨资源圃的‘砀山酥梨’。采摘开花前12天的‘砀山酥梨’花蕾，切取花柱，称鲜质量后贮存于液氮中备用，花粉取材后放于干燥剂中并置于20℃冰柜中存放，试验前进行活力测试，达到萌发标准即可用于下游试验。
1．2 实验方法
1．2．1花柱SRNase的提取
采用Hiratsuka等方法[21]，取‘砀山酥梨’花柱4 g置于盛有液氮的研钵中，研磨至粉碎状后倒入事先加入MES/NaOH缓冲液的烧杯中，并迅速加入蛋白质提取液，在冰冷条件下搅拌30 min后4℃下离心，用CM琼脂糖凝胶层析柱分离S糖蛋白，并回收不含S糖蛋白的花柱可溶性蛋白。用NaCl盐溶液将吸附于层析柱上的S糖蛋白溶出，通过SP琼脂糖凝胶离子交换层析柱进一步纯化，回收的S糖蛋白经平衡透析后贮存于80℃冰箱中待用。
1．2．2 SDS蛋白质凝胶电泳
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 实验材料 2
1.2 实验方法 2
1.2.1 花柱SRNase的提取2
1.2.2 SDS 蛋白质凝胶电泳3
1.2.3 花粉离体培养3
1.2.4 梨花柱SRNase活力测定3
2 结果与分析3
2.1 SDS蛋白凝胶电泳结果3
2.2 梯度浓度酸性物质处理后花粉管生长情况4
2.2.1 不同浓度柠檬酸处理后梨花粉管生长情况4
2.2.2 不同浓度乙酸处理后梨花粉管生长情况5
2.3 酸性物质对SRNase活性的影响6
2.3.1 柠檬酸对SRNase活性的影响6
2.3.2 乙酸对SRNase活性的影响7
2.4 SRNase蛋白活力测定 8
3 讨论 8
致谢9
参考文献9
RNase T2诱导梨花粉管死亡的毒理学分析
引言
自交不亲和性（Selfincompatibility，SI）是显花植物雌蕊的花柱或柱头可以识别自体花粉或S基因
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
型相同的异体花粉，并抑制其萌发或生长的一种特性。自交不亲和使自体受精不能实现，只有遗传组成不相同的异体花粉才能完成受精，是显花植物防止近亲繁殖、促进异交和保持遗传变异的一种特性，也是植物物种多样性的一个诱因。根据遗传控制方式，植物自交不亲和性可分为孢子体型自交不亲和性（Sporophytic selfincompatibility，SSI）和配子体型自交不亲和性（Gametophytic selfincompatibility，GSI）。孢子体型自交不亲和性的花粉表型由孢子体（产生花粉的植株）基因型决定，配子体型自交不亲和性的花粉表型由其自身的单倍体S基因型决定，花粉管生长的抑制一般发生在花柱的传递组织中。梨是典型的蔷薇科配子体型自交不亲和植物，当花粉与花柱中相同S基因型特异性表达之后自交不亲和反应就会发生，导致花粉管在花柱中停止生长。
目前，控制配子体型自交不亲和性的雌蕊和花粉决定因子已被确定，分别是SRNase和Fbox基因[1]。特定的S等位基因相关蛋白最早在月见草（Oenothera organesis）中被分离出来[2]。Anderson等在1986年首次克隆出cDNA编码的S等位基因糖蛋白[3]，推导出的氨基酸序列有力地证明了花柱RNase参与了花柱中的识别和抑制反应。另外在茄科植物中，花柱S等位基因的产物是一种序列中含有真菌RNase T2活性位点的糖蛋白[4]，是一种核酸酶，称为S核酸酶（SRNase）[56]。1994年在矮牵牛和烟草中进行的基因改造分析实验证明了在茄科植物中SRNase决定了配子体型自交不亲和性花粉抑制反应的特异性[78]。Sassa和Broothaerts等也分别报道了SRNase参与蔷薇科梨属和苹果属的配子体自交不亲和反应[912]。
核糖核酸酶（Ribonuclease，RNase）的主要功能是催化RNA的水解，它作用于RNA的3,5磷酸二酯键，产物是5磷酸核苷和3磷酸核苷，在生命活动中发挥着重要的调节作用。生物中的核糖核酸酶有RNase T1、RNase T2和RNase A三种。RNase A主要存在于动物中，RNase T1在真菌和细菌中较为常见，RNase T2则分布于原生动物、植物、细菌、动物和病毒中[13]。T2家族核糖核酸酶是转移酶类型的RNA酶，因为他们与米曲霉中的RNase T2具有相似性[1415]，该家族能刺激单链RNA通过23磷酸循环中间体裂解，生成具有3端的单链核苷酸或寡核苷酸。目前提出的RNase T2的生物学功能包括清除核酸、自身RNA的降解以及作为外源或内源细胞毒素等[16]。在茄科中一系列的实验指出，SRNase在花粉管中通过RNase起到了细胞毒素的作用，且SRNase活性在矮牵牛的花粉拒绝反应中是必须的[17]。
目前，关于SRNase导致花粉管死亡的功能研究认为，花柱自我SRNase能进入花粉管内降解花粉管内RNA，导致蛋白质合成受阻，花粉管发生细胞程序性死亡（programmed cell death，PCD）[18]。利用荧光标记、透射电镜和蛋白免疫印迹等技术证实该死亡属于细胞程序性死亡类型[19]。在虞美人花粉自交不亲和的细胞程序性死亡过程中发现了花粉管液泡的酸化，并指出pH降低可能抑制花粉生长所需的可溶性焦磷酸酶和触发自交不亲和性PCD的信号途径[20]。因为大部分RNase T2保持最佳活性的pH值一般维持在45之间，其最适pH的活性与它们在液泡或溶酶体中的位置具有一致性，表明这些核糖核酸酶的功能之一是使带有酸性分层的自身RNA发生降解[16]。因此认为一定酸性条件能够增强SRNase对花粉管的抑制。为验证这一假设，本实验通过不同种类的酸与SRNase同时处理花粉管，进而建立酸与SRNase之间的联系，为SRNase的毒理性研究提供新的证据。
1 材料与方法
1．1 实验材料
用于试验的花粉和花柱为2015年取于大学江浦农场园艺试验站梨资源圃的‘砀山酥梨’。采摘开花前12天的‘砀山酥梨’花蕾，切取花柱，称鲜质量后贮存于液氮中备用，花粉取材后放于干燥剂中并置于20℃冰柜中存放，试验前进行活力测试，达到萌发标准即可用于下游试验。
1．2 实验方法
1．2．1花柱SRNase的提取
采用Hiratsuka等方法[21]，取‘砀山酥梨’花柱4 g置于盛有液氮的研钵中，研磨至粉碎状后倒入事先加入MES/NaOH缓冲液的烧杯中，并迅速加入蛋白质提取液，在冰冷条件下搅拌30 min后4℃下离心，用CM琼脂糖凝胶层析柱分离S糖蛋白，并回收不含S糖蛋白的花柱可溶性蛋白。用NaCl盐溶液将吸附于层析柱上的S糖蛋白溶出，通过SP琼脂糖凝胶离子交换层析柱进一步纯化，回收的S糖蛋白经平衡透析后贮存于80℃冰箱中待用。
1．2．2 SDS蛋白质凝胶电泳
版权保护: 本文由 hbsrm.com编辑，转载请保留链接: www.hbsrm.com/nongxue/yy/521.html
