草莓品种‘cf’脱毒苗的获得及抗旱性鉴定
摘要：本文以草莓（Fragaria×ananassa?Duch）品种为实验材料，用其茎尖为外植体建立草莓无菌繁殖体系，并对获得的组培苗进行扩繁，并对部分组培苗进行脱毒处理，经继代生根培养后，炼苗移栽至大田，随后对其进行病毒检测。研究主要目的是检测茎尖培养脱除几种草莓常见病毒(SCrV,SMoV,SMYEV,SVBV)效果。针对4种常见草莓病毒外壳蛋白基因的部分序列，设计特异性引物，采用多重RT-PCR技术，快速、同步、特异、高灵敏度地检测植株体内是否有感染寄主植物的4种病毒。并对移栽至田间观察干旱处理前后其植物学特征、生物学特征。结果表明，多重RT-PCR显示，脱毒效果欠佳，4种病毒同时脱除比率仅为37.5%,大部分植株SVBV病毒未脱除。脱毒苗生长势显著高于未脱毒苗，其中3株脱毒苗已繁殖出匍匐茎，2株脱毒苗于5月中旬进入花期，1株脱毒苗于5月中旬处于果期，就萎蔫程度而言脱毒苗抗旱性较高于未脱毒植株。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1.1 试材 2
1.1.1 植物材料 2
1.1.2试剂和试剂盒 2
1.2 方法 3
1.2.1草莓无菌苗的构建 3
1.2.2 脱毒方法 3
1.2.3 提取优质草莓总RNA 4
1.2.4 病毒检测 4
1.2.5 草莓脱毒效果检测 4
1.2.6 电泳技术 6
1.2.7 植株田间生长势测定 6
1.2.8 大田田间干旱处理 6
1.3数据处理 6
2 结果与分析 6
2.1 草莓无菌苗构建结果 6
2.2 草莓总RNA提取结果 6
2.3 多重PCR病毒检测体系的建立 7
2.4 草莓CF脱毒苗与未脱毒苗生长势比较 8
2.5 草莓CF脱毒苗与未脱毒苗干旱处理下生长势比较 8
3 讨论 9
致谢 9
参考文献 9
草莓品种‘CF’脱毒
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
苗的获得及抗旱性鉴定
引言
引言
草莓(Fragaria chiloensis.Duch.Bail.)是蔷薇科多年生草本植物,2000年我国的草莓栽培面积达36 700.h㎡,居世界首位,产量约为3.57×105 t,仅次于美国[1].但由于栽培草莓都是通过无性繁殖,病毒侵染之后,随同无性繁殖材料传播扩散.因此无性繁殖数量越大,病毒传播速度也越快.通过几年的栽培后,受病毒的危害,引进的品种果实变小、品质变劣、产量降低等退化现象普遍发生[1] 。
草莓病毒病在世界范围内广泛，其中对草莓生产造成严重影响的主要有四大病毒：草莓斑驳病毒(Strawberry mottle virus, SmoV)、草莓轻型黄边病毒(Strawberry mild yellow edge virus, SMYEY)、草莓镶脉病毒(Strawberry vein band virus, SVBV)和草莓皱缩病毒(Strawberry crinkle virus, SCrV)。我国也曾对草莓主栽区的病毒种类及其危害情况进行了调查研究[2]，对一些重要病毒如草莓斑驳病毒、草莓皱缩病毒、草莓镶脉病毒、草莓轻型黄边病毒、草莓伪轻型黄边病毒进行了鉴定[26]。
以聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)和反转录一聚合酶链式反应(Reverse transcriptio polymerase chain reaction, RTPCR)技术为代表的分子生物学检测技术，因其在病毒检测过程中具有快速、灵敏度高、费用相对较低等优点，正逐渐成为植物病毒检测的主要方法和手段[7]。
草莓CF系美国的加工品种，具有花期长，开花数量多，结果率高，果大，口感好，产量高，经济效益好的特点。但是CF品种也有相应易感褪色斑点病、枯萎病的缺点。
本实验以草莓品种CF为实验材料，建立带病毒苗的组培苗体系，并对带有病毒病的组培苗进行扩繁，以获得一批脱毒苗，然后进行RTPCR检测，计算出CF品种的脱毒率。检测后进行生根、炼苗；炼苗后进行匍匐茎的繁殖。检测成功后脱毒苗可投入到大田中生产。将脱毒的CF品种和未脱毒的CF移入田间后进行干旱处理，观察其生物学特征，生物学特性包括草莓植株的生长势、叶片的大小数量等。测其植株株高、叶长、叶宽和叶柄长等。比较草莓脱毒苗和相应普通苗植株高低以及生长势大小，观察其脱毒后是否存在优越性。为此通过此技术，期望达到用草莓脱毒技术来提高草莓抗病性，增强其抗逆性等优点，发现并利用草莓脱毒苗的优势以达到改良草莓品质，推广使用草莓优良品种，提高草莓产量，为广大农民谋福利。
1 材料与方法
1.1 试材
1.1.1 植物材料
供试验的材料为‘CF’草莓品种。现植栽于大学果树实验室。
1.1.2 试剂和试剂盒
1.1.2.1 RNA提取所用溶液：
配制方法：先把各试剂配在一起加水到47.5mL，DEPC处理，高压灭菌。同时，用DEPC处理过的水配制50mL TrisHCl(PH8.0)的溶液，取所需要加入到前面灭过菌的溶液。
其他试剂购国产分析纯试剂。如下表1 TE缓冲液 表2CTAB提取液
表1 TE缓冲液
Table 1 TE buffer
试剂
浓度
Tris
1.21g/L
EDTA(0.5)
2ml/L
NaCl
5.84g/L
表2 100mLCTAB（2%）提取液
Table 2 100mL CTAB(2%) extract
试剂
母液
取出体积（mL)
0.1M TrisHCl
1M(PH=8)
10
0.02M EDTA
0.5M(PH=8)
4
1.4M NaCl
5M
28
2%PVP
2g
2%CTAB
2g
用之前加入1%的β羟基乙醇，无菌水定容至100mL。
1.1.2.2 反转录
MMLV及5xMMLV Buffer 由 TaKaRa 公司提供。
1.1.2.3 引物
由上海英俊生物技术公司合成
1.2 方法
1.2.1 草莓无菌苗的构建
(1)选择无病虫、品种纯正的健壮植株，栽于盆中，待其发生匍匐茎，取匍匐茎顶端的34 cm长的顶芽，用流水冲洗12小时，冲洗干净;
(2)将表面清洗过的顶芽置于超净工作台上，用70%酒精表面消毒40 s;
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1.1 试材 2
1.1.1 植物材料 2
1.1.2试剂和试剂盒 2
1.2 方法 3
1.2.1草莓无菌苗的构建 3
1.2.2 脱毒方法 3
1.2.3 提取优质草莓总RNA 4
1.2.4 病毒检测 4
1.2.5 草莓脱毒效果检测 4
1.2.6 电泳技术 6
1.2.7 植株田间生长势测定 6
1.2.8 大田田间干旱处理 6
1.3数据处理 6
2 结果与分析 6
2.1 草莓无菌苗构建结果 6
2.2 草莓总RNA提取结果 6
2.3 多重PCR病毒检测体系的建立 7
2.4 草莓CF脱毒苗与未脱毒苗生长势比较 8
2.5 草莓CF脱毒苗与未脱毒苗干旱处理下生长势比较 8
3 讨论 9
致谢 9
参考文献 9
草莓品种‘CF’脱毒
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苗的获得及抗旱性鉴定
引言
引言
草莓(Fragaria chiloensis.Duch.Bail.)是蔷薇科多年生草本植物,2000年我国的草莓栽培面积达36 700.h㎡,居世界首位,产量约为3.57×105 t,仅次于美国[1].但由于栽培草莓都是通过无性繁殖,病毒侵染之后,随同无性繁殖材料传播扩散.因此无性繁殖数量越大,病毒传播速度也越快.通过几年的栽培后,受病毒的危害,引进的品种果实变小、品质变劣、产量降低等退化现象普遍发生[1] 。
草莓病毒病在世界范围内广泛，其中对草莓生产造成严重影响的主要有四大病毒：草莓斑驳病毒(Strawberry mottle virus, SmoV)、草莓轻型黄边病毒(Strawberry mild yellow edge virus, SMYEY)、草莓镶脉病毒(Strawberry vein band virus, SVBV)和草莓皱缩病毒(Strawberry crinkle virus, SCrV)。我国也曾对草莓主栽区的病毒种类及其危害情况进行了调查研究[2]，对一些重要病毒如草莓斑驳病毒、草莓皱缩病毒、草莓镶脉病毒、草莓轻型黄边病毒、草莓伪轻型黄边病毒进行了鉴定[26]。
以聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)和反转录一聚合酶链式反应(Reverse transcriptio polymerase chain reaction, RTPCR)技术为代表的分子生物学检测技术，因其在病毒检测过程中具有快速、灵敏度高、费用相对较低等优点，正逐渐成为植物病毒检测的主要方法和手段[7]。
草莓CF系美国的加工品种，具有花期长，开花数量多，结果率高，果大，口感好，产量高，经济效益好的特点。但是CF品种也有相应易感褪色斑点病、枯萎病的缺点。
本实验以草莓品种CF为实验材料，建立带病毒苗的组培苗体系，并对带有病毒病的组培苗进行扩繁，以获得一批脱毒苗，然后进行RTPCR检测，计算出CF品种的脱毒率。检测后进行生根、炼苗；炼苗后进行匍匐茎的繁殖。检测成功后脱毒苗可投入到大田中生产。将脱毒的CF品种和未脱毒的CF移入田间后进行干旱处理，观察其生物学特征，生物学特性包括草莓植株的生长势、叶片的大小数量等。测其植株株高、叶长、叶宽和叶柄长等。比较草莓脱毒苗和相应普通苗植株高低以及生长势大小，观察其脱毒后是否存在优越性。为此通过此技术，期望达到用草莓脱毒技术来提高草莓抗病性，增强其抗逆性等优点，发现并利用草莓脱毒苗的优势以达到改良草莓品质，推广使用草莓优良品种，提高草莓产量，为广大农民谋福利。
1 材料与方法
1.1 试材
1.1.1 植物材料
供试验的材料为‘CF’草莓品种。现植栽于大学果树实验室。
1.1.2 试剂和试剂盒
1.1.2.1 RNA提取所用溶液：
配制方法：先把各试剂配在一起加水到47.5mL，DEPC处理，高压灭菌。同时，用DEPC处理过的水配制50mL TrisHCl(PH8.0)的溶液，取所需要加入到前面灭过菌的溶液。
其他试剂购国产分析纯试剂。如下表1 TE缓冲液 表2CTAB提取液
表1 TE缓冲液
Table 1 TE buffer
试剂
浓度
Tris
1.21g/L
EDTA(0.5)
2ml/L
NaCl
5.84g/L
表2 100mLCTAB（2%）提取液
Table 2 100mL CTAB(2%) extract
试剂
母液
取出体积（mL)
0.1M TrisHCl
1M(PH=8)
10
0.02M EDTA
0.5M(PH=8)
4
1.4M NaCl
5M
28
2%PVP
2g
2%CTAB
2g
用之前加入1%的β羟基乙醇，无菌水定容至100mL。
1.1.2.2 反转录
MMLV及5xMMLV Buffer 由 TaKaRa 公司提供。
1.1.2.3 引物
由上海英俊生物技术公司合成
1.2 方法
1.2.1 草莓无菌苗的构建
(1)选择无病虫、品种纯正的健壮植株，栽于盆中，待其发生匍匐茎，取匍匐茎顶端的34 cm长的顶芽，用流水冲洗12小时，冲洗干净;
(2)将表面清洗过的顶芽置于超净工作台上，用70%酒精表面消毒40 s;
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