荷花葡萄糖6磷酸脱氢酶基因家族的鉴定与分析
摘要：作为在戊糖磷酸途径（PPP）中的关键酶，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PDH）为植物提供了烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH），其在植物发育和应激反应中都起着重要作用。在这项研究中，我们在全基因组范围鉴定出荷花的三种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因（NnG6PDH1、NnG6PDH2和NnG6PDH3）。NnG6PDHs基因cDNA的全长在1557 bp至1779 bp之间，编码518至600个数量不等的氨基酸所组成的肽链。基因结构功能域的特征分析表明NnG6PDHs所编码的蛋白含有典型的保守结构，即：包括C-末端的活性位点，N-末端NAD（P）结合位点。系统发育分析和亚细胞定位预测表明NnG6PDH3是胞质型，而另外两个基因是质体型。启动子区的预测和分析表明NnG6PDHs存在大量响应胁迫和激素的顺式作用元件，例如 ERF1、AG和HMG-I/Y等，暗示它们在植物中发挥重要的功能。
目录
摘要1
关键词1
Abstract 1
Key words2
引言2
1 材料与方法3
1.1 供试材料3
1.2 方法 3
1.2.1 基因的鉴定 3
1.2.2 顺式调控元件的识别4
1.2.3 系统发生树的构建 4
1.2.4 基因结构分析4
2 结果与分析 4
2.1 基因组范围鉴定荷花G6PDH基因4
2.2 NnG6PDH基因的结构 5
2.3 顺式调控元件5
2.4 NnG6PDH三维结构的预测 7
2.5多序列比对和结构分析 8
2.6 NnG6PDHs的系统发育 9
讨论10
致谢11
参考文献12
荷花葡萄糖6磷酸脱氢酶基因家族的鉴定与分析
引言
引言
戊糖磷酸途径是一个主要的糖代谢途径，在植物发育和应激反应中都起着重要作用(Laliotis et al. 2007; Nogae and Johnston 1990)。作为戊糖磷酸途径（PPP）中的关键酶(Luzzatt
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
o and Battistuzzi 1974)，葡萄糖6磷酸脱氢酶（G6PDH）广泛存在于植物组织、细胞质、质体和过氧化物酶体(Corpas et al. 1998; Knight et al. 2001; Yinggao et al. 2007)，维持碳的流动并控制烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）的合成(Rüdiger and Antje 2003; Wendt et al. 2000)。另外，葡萄糖6磷酸脱氢酶（G6PDH）为其他细胞功能提供了烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH），并将前体分子转换成化合物以供芳香族氨基酸、核酸和辅酶的生物合成。事实上，和黑暗中光合组织一样，OPPP在非光合组织中是NADPH的主要来源之一(Emes and Neuhaus 1997)。
大量数据表明，多种环境因素调控葡萄糖6磷酸脱氢酶(G6PDH)基因，例如盐碱胁迫(Gao et al. 2016; Nemoto and Sasakuma 2000; Wang et al. 2016)、热胁迫(Gong et al. 2012)、低温胁迫(Lin et al. 2010)、氧化应激(Leopold and Loscalzo 2000; Yinggao et al. 2007)和重金属胁迫(Esposito et al. 1998)。用紫外线照射欧芹细胞会增加葡萄糖6磷酸脱氢酶(G6PDH)基因转录的比例(Elke Logemann 2000)，用诱导子产生氧化应激将刺激烟草细胞葡萄糖6磷酸脱氢酶(G6PDH)的活动(Xiaomin et al. 2008; Yu et al. 2004)。和表达内源性葡萄糖6磷酸脱氢酶(G6PDH)的细胞相比，缺乏G6PDH的细胞对氧化应激高度敏感。葡萄糖6磷酸脱氢酶(G6PDH)的防护作用部分决定了它在调控NAPDH生产中的作用。Xiaomin et al. (2008)表明在盐碱胁迫下GHS维持和H2O2积累和G6PDH的活动有关。氧化应激下的抑制剂谷胱甘肽合成增加G6PDH活性，而GSH前体抑制G6PDH活动(Yu et al. 2004)。除了非生物胁迫，G6PDHs和生物胁迫也相关(Batz et al. 1998; ?indelá? and ?indelá?ová 2002)。而且事实证明，它们对种子萌发(Han et al. 1998)、脂肪积累(Long et al. 2016; Wakao et al. 2008)和氮同化(Esposito et al. 2001; Wang et al. 2003)有相关作用。
被证实G6PDH基因存在于草莓(Yuan 2010)、土豆(Schaewen et al. 1995; Wendt et al. 2000)、烟草(Debnam et al. 2004)、枇杷树(Hirai 1981)、小麦(Nemoto and Sasakuma 2000)、大麦(Wright et al. 1997)、大豆(Hong and Copeland 1991)和拟南芥(Hofmann 2012; Wakao et al. 2008)等一些植物中。G6PDH有细胞质和质体两个亚细胞定位，这两者都是由核基因编码被发现(Huang 2004; Rüdiger and Antje 2003)。活动分析表明，它们是由NADPH反馈抑制(Gao et al. 2016; Thomas et al. 2002)。基于成熟蛋白质和蛋白质的免疫特性的序列相似性，在植物中质体G6PDH同种型分为两类，P1和P2(Hou et al. 2006)。P1被绿色组织光合作用氧化还原系统调节，而P2对光合系统略敏感(Wakao et al. 2008)。
荷花是白垩纪遗留的植物之一，广泛应用于食物、装饰、医药和加工(Zhang et al. 2013)。目前为止，几乎没有关于荷花G6PDHs基因的信息。在过去，由于缺少荷花的基因组序列，完整的鉴定一个基因家族是不可能的(Wakao et al. 2008)。近日，莲花的基因组进行了测序，并在NCBI提供，这有利于分析莲花的全基因组(Ming et al. 2013)。在这项研究中，荷花的一种胞质型NnG6PDH3、质体型NnG6PDH1和NnG6PDH2第一次被鉴定和克隆。该G6PDH组的分析包括其表达将提高OPPO在荷花的生理作用。
1 材料与方法
1．1 供试材料
荷花，大肠杆菌coli DH5α细胞
1．2 试验方法
1．2．1 基因的鉴定
为了分离和鉴定荷花G6PDH基因序列，使用拟南芥和水稻的G6PDH基因被作为比对序列，以此来搜索、对比荷花的基因组数据。根据所得到的重叠群的序列，设计多对引物用于NnG6PDH的cDNAs的PCR扩增（表1）。PCR扩增得到的产物被克隆到PMD18T克隆载体（宝生物工程科技公司，大连，中国），然后转化到大肠杆菌coli DH5α细胞中，所获得的全长cDNA序列在BLAST中比对搜索，并使用NCBI数据库进行其他的生物信息分析。
表1克隆扩增引物
目录
摘要1
关键词1
Abstract 1
Key words2
引言2
1 材料与方法3
1.1 供试材料3
1.2 方法 3
1.2.1 基因的鉴定 3
1.2.2 顺式调控元件的识别4
1.2.3 系统发生树的构建 4
1.2.4 基因结构分析4
2 结果与分析 4
2.1 基因组范围鉴定荷花G6PDH基因4
2.2 NnG6PDH基因的结构 5
2.3 顺式调控元件5
2.4 NnG6PDH三维结构的预测 7
2.5多序列比对和结构分析 8
2.6 NnG6PDHs的系统发育 9
讨论10
致谢11
参考文献12
荷花葡萄糖6磷酸脱氢酶基因家族的鉴定与分析
引言
引言
戊糖磷酸途径是一个主要的糖代谢途径，在植物发育和应激反应中都起着重要作用(Laliotis et al. 2007; Nogae and Johnston 1990)。作为戊糖磷酸途径（PPP）中的关键酶(Luzzatt
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
o and Battistuzzi 1974)，葡萄糖6磷酸脱氢酶（G6PDH）广泛存在于植物组织、细胞质、质体和过氧化物酶体(Corpas et al. 1998; Knight et al. 2001; Yinggao et al. 2007)，维持碳的流动并控制烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）的合成(Rüdiger and Antje 2003; Wendt et al. 2000)。另外，葡萄糖6磷酸脱氢酶（G6PDH）为其他细胞功能提供了烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH），并将前体分子转换成化合物以供芳香族氨基酸、核酸和辅酶的生物合成。事实上，和黑暗中光合组织一样，OPPP在非光合组织中是NADPH的主要来源之一(Emes and Neuhaus 1997)。
大量数据表明，多种环境因素调控葡萄糖6磷酸脱氢酶(G6PDH)基因，例如盐碱胁迫(Gao et al. 2016; Nemoto and Sasakuma 2000; Wang et al. 2016)、热胁迫(Gong et al. 2012)、低温胁迫(Lin et al. 2010)、氧化应激(Leopold and Loscalzo 2000; Yinggao et al. 2007)和重金属胁迫(Esposito et al. 1998)。用紫外线照射欧芹细胞会增加葡萄糖6磷酸脱氢酶(G6PDH)基因转录的比例(Elke Logemann 2000)，用诱导子产生氧化应激将刺激烟草细胞葡萄糖6磷酸脱氢酶(G6PDH)的活动(Xiaomin et al. 2008; Yu et al. 2004)。和表达内源性葡萄糖6磷酸脱氢酶(G6PDH)的细胞相比，缺乏G6PDH的细胞对氧化应激高度敏感。葡萄糖6磷酸脱氢酶(G6PDH)的防护作用部分决定了它在调控NAPDH生产中的作用。Xiaomin et al. (2008)表明在盐碱胁迫下GHS维持和H2O2积累和G6PDH的活动有关。氧化应激下的抑制剂谷胱甘肽合成增加G6PDH活性，而GSH前体抑制G6PDH活动(Yu et al. 2004)。除了非生物胁迫，G6PDHs和生物胁迫也相关(Batz et al. 1998; ?indelá? and ?indelá?ová 2002)。而且事实证明，它们对种子萌发(Han et al. 1998)、脂肪积累(Long et al. 2016; Wakao et al. 2008)和氮同化(Esposito et al. 2001; Wang et al. 2003)有相关作用。
被证实G6PDH基因存在于草莓(Yuan 2010)、土豆(Schaewen et al. 1995; Wendt et al. 2000)、烟草(Debnam et al. 2004)、枇杷树(Hirai 1981)、小麦(Nemoto and Sasakuma 2000)、大麦(Wright et al. 1997)、大豆(Hong and Copeland 1991)和拟南芥(Hofmann 2012; Wakao et al. 2008)等一些植物中。G6PDH有细胞质和质体两个亚细胞定位，这两者都是由核基因编码被发现(Huang 2004; Rüdiger and Antje 2003)。活动分析表明，它们是由NADPH反馈抑制(Gao et al. 2016; Thomas et al. 2002)。基于成熟蛋白质和蛋白质的免疫特性的序列相似性，在植物中质体G6PDH同种型分为两类，P1和P2(Hou et al. 2006)。P1被绿色组织光合作用氧化还原系统调节，而P2对光合系统略敏感(Wakao et al. 2008)。
荷花是白垩纪遗留的植物之一，广泛应用于食物、装饰、医药和加工(Zhang et al. 2013)。目前为止，几乎没有关于荷花G6PDHs基因的信息。在过去，由于缺少荷花的基因组序列，完整的鉴定一个基因家族是不可能的(Wakao et al. 2008)。近日，莲花的基因组进行了测序，并在NCBI提供，这有利于分析莲花的全基因组(Ming et al. 2013)。在这项研究中，荷花的一种胞质型NnG6PDH3、质体型NnG6PDH1和NnG6PDH2第一次被鉴定和克隆。该G6PDH组的分析包括其表达将提高OPPO在荷花的生理作用。
1 材料与方法
1．1 供试材料
荷花，大肠杆菌coli DH5α细胞
1．2 试验方法
1．2．1 基因的鉴定
为了分离和鉴定荷花G6PDH基因序列，使用拟南芥和水稻的G6PDH基因被作为比对序列，以此来搜索、对比荷花的基因组数据。根据所得到的重叠群的序列，设计多对引物用于NnG6PDH的cDNAs的PCR扩增（表1）。PCR扩增得到的产物被克隆到PMD18T克隆载体（宝生物工程科技公司，大连，中国），然后转化到大肠杆菌coli DH5α细胞中，所获得的全长cDNA序列在BLAST中比对搜索，并使用NCBI数据库进行其他的生物信息分析。
表1克隆扩增引物
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