涝害胁迫对龙井长叶生理特性的影响
摘要：涝害是世界上大多数国家面临的重大自然灾害之一，涝害引起作物一系列的伤害甚至死亡，严重限制了作物的分布及产量。茶树是我国重要经济作物，对我国的经济发展有着重要作用。本试验以‘龙井长叶’为材料，进行涝害处理，通过研究龙井长叶在涝害胁迫下的可溶性糖、过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）、脯氨酸、丙二醛（MDA）等生理指标的变化,为今后茶树的栽培应用及抗性品种的选育提供基础数据，为茶树抗涝种质的改良、创新等研究提供理论依据，解决影响茶树产量的问题，提高茶树经济效益。
目录
摘要2
关键词2
Abstract2
Key words2
引言2
1材料与方法3
1.1试验材料与设计3
1.1.1试验材料 3
1.1.2涝害试验设计3
1.2试验内容与方法3
1.2.1涝害胁迫对茶苗生理指标的影响3
2结果与分析5
2.1涝害结果分析5
2．1．1 涝害胁迫对茶苗叶片抗氧化酶系和膜脂过氧化作用的影 5
2．1．2 涝害胁迫对茶苗渗透调节作用的影响 7
3讨论9
3．1 茶树耐涝性与茶苗叶片抗氧化酶系和膜脂过氧化作用的关系9
3．2茶树耐涝性与茶苗渗透调节作用的关系9 3.3茶树耐涝性与其叶片生理生化指标的关系10
3.4总结10
致谢10
参考文献11
涝害胁迫对龙井长叶生理特性的影响
引言
20世纪以来，频繁的气候变化往往使人类面临众多的自然灾害，作为植物生长过程中不可或缺的环境因素水分而言，其引起的自然灾害更是造成了重大的负面影响。据统计，水分胁迫造成的经济损失达到了全部自然灾害6070%，水分胁迫可分为干旱胁迫和涝害胁迫，当土壤中水分过多，大大超出植物对水分的需求量，引起植物根系缺氧，导致烂根死苗，为涝害胁迫[1]。
涝害又称渍涝，是土壤中水分含量超过植物正常生长发育所需量而导致植物受到损伤危害。涝害是世界上大多数国家面临的重大自然灾害之一[2]。据统计，我国黄淮平原以及长江中下游因为涝害所遭受的经济损失最
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严重，其受灾面积也达到了全国面积总和的3/4以上[3]。涝害由于水分含量过高导致植物体缺氧，无法正常的吸收营养和水分，从而对植物造成次生胁迫伤害。植物由于缺氧进行无氧呼吸所产生的代谢物均有一定的毒性，这些物质的累积进一步对植物根系等处产生毒害作用。同时由于植物吸收水分不足导致蒸腾作用减弱，光合作用也受到不利影响。在涝害逆境下，植物体通过提高渗透调剂物质、抗氧化保护机制等方面来适应涝害环境，增强其耐涝性。关于水分胁迫下作物耐涝性的研究要在细胞、形态、基因等各个方面不断的深入，研究植物在各个水平对涝害的响应方式，只有这样才能从根本上解决水分胁迫问题[4]。
1 材料与方法
1．1 试验材料与设计
1．1．1 试验材料
试验于江苏省南京市大学茶学研究所进行。试验品种为1年生“龙井长叶”茶苗，长势和大小基本一致（穴盘苗），由溧水茶园提供。2015年3月初，将茶苗移栽入口径25cm、高30cm的塑料花盆中，光照、水分管理养护一致。试验于3月29日正式展开。
1．1．2 涝害试验设计
以“龙井长叶”为试验材料，保持水淹状态，每天下午5：00用感量为1g的电子天平称量花盆的质量，持续处理21d后取茶苗23位叶测定各项指标。本试验采用完全随机试验设计，重复3次。
1．2 试验内容与方法
1．2．1 涝害胁迫对茶苗生理指标的影响
在涝害第21天上午8点取茶苗中上部成熟叶片并用锡箔纸包裹，用液氮速冻备用。参照王学奎[6]（2006）等方法进行测定，均使用UV2550紫外分光光度计。
（1）过氧化物酶（POD）活性测定
测定POD活性采用愈创木酚法。取植物叶片（去叶脉）0.25g于预冷的研钵中，1mL预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆（研磨时添加0.1 g PVP），加缓冲液至体积为5mL，于4000rpm下离心10min，取上清液。建立由2.9ml0.05 mol/L 磷酸缓冲液+1.0ml2%H2O2+1.0ml0.05 mol/L 愈创木酚组成的反应体系，对照为煮沸5min的酶液。在向上述反应体系中加入酶液之后，立即将其置于37℃温水中水浴保温15min，然后迅速转入冰水中进行冰浴，并加入2.0mL20%三氯乙酸溶液终止反应，然后以5000r/min的速度离心10min，在470nm波长下用紫外分光光度计测定吸光度，每20s读数一次，连续2min。
式中ΔA=反应时间内的吸光度变化；V1=提取酶液总体积（ml）；V2=测定时取用酶液体积（ml）；t=反应时间（min）；w=植物鲜重（g）
(2)超氧化物歧化酶（SOD）活性测定
采用氮蓝四唑（NBT）法测定。取0.25g茶树叶片（根据需要可去叶脉）放入预冷的研钵中，在冰浴的条件下加入1mL预冷的磷酸缓冲液将叶片研磨成浆（研磨时添加0.1gPVP），加缓冲液至体积为5mL，以4000rpm的速度离心10min，保留上清液。取1mL粗酶液稀释至10mL。
取5支透明度好的5mL指形管，以2支为对照管，另3支为测定管，在试管中加入1.5ml 0.05mol/l 磷酸缓冲液(pH7.8)+0.3ml 130mmol/L 甲硫氨酸溶液+ 0.3ml 750μmol/L NBT溶液 + 0.3ml100μmol/LEDTANa2溶液+ 0.3ml 20μmol/L核黄素溶液+ 0.2ml 蒸馏水，于一支对照管中加入0.1ml磷酸缓冲液，其余加入0.1ml酶提取液，各管混匀后将1支对照管置暗处，其它各管于4000 lx光照强度下反应20 min。以不照光的对照管做空白，至反应结束以后，分别测定其他各管的吸光度。
式中A1为照光的对照管吸光度；A2为样品管反应液吸光度值；V1为样液总体积（ml）；
V2为测定时样品用量（ml）；w为样品鲜重（g）
（3）可溶性糖含量的测定
采用蒽酮比色法测定。将蔗糖在80℃的条件下烘至质量恒定，精确称取1.000g，于少量水中溶解，转入100mL容量瓶中，加入0.5mL浓硫酸，用蒸馏水定容到刻度。再精确吸取1mL1%蔗糖标准液至100mL容量瓶中，定容，制为100μg/L 蔗糖液。取6支200mL刻度试管，编号05，按表1.1加入水和溶液。然后加入5mL浓硫酸和0.5蒽酮乙酸乙酯试剂，震荡充分后，在100℃水中进行水浴，每个试管保温1min，取出试管后自然冷却至室温，以空白作参比。在630nm下以紫外分光光度计测其吸光度，以糖含量和吸光度分别作为横坐标与纵坐标，绘制含糖量和吸光度的标准曲线，求出相应的线性方程。
表1.1 蒽酮法可溶性糖标准曲线各试剂加入量
Table 2.1 Standard curve of each soluble sugar reagent dosage of Anthrone
目录
摘要2
关键词2
Abstract2
Key words2
引言2
1材料与方法3
1.1试验材料与设计3
1.1.1试验材料 3
1.1.2涝害试验设计3
1.2试验内容与方法3
1.2.1涝害胁迫对茶苗生理指标的影响3
2结果与分析5
2.1涝害结果分析5
2．1．1 涝害胁迫对茶苗叶片抗氧化酶系和膜脂过氧化作用的影 5
2．1．2 涝害胁迫对茶苗渗透调节作用的影响 7
3讨论9
3．1 茶树耐涝性与茶苗叶片抗氧化酶系和膜脂过氧化作用的关系9
3．2茶树耐涝性与茶苗渗透调节作用的关系9 3.3茶树耐涝性与其叶片生理生化指标的关系10
3.4总结10
致谢10
参考文献11
涝害胁迫对龙井长叶生理特性的影响
引言
20世纪以来，频繁的气候变化往往使人类面临众多的自然灾害，作为植物生长过程中不可或缺的环境因素水分而言，其引起的自然灾害更是造成了重大的负面影响。据统计，水分胁迫造成的经济损失达到了全部自然灾害6070%，水分胁迫可分为干旱胁迫和涝害胁迫，当土壤中水分过多，大大超出植物对水分的需求量，引起植物根系缺氧，导致烂根死苗，为涝害胁迫[1]。
涝害又称渍涝，是土壤中水分含量超过植物正常生长发育所需量而导致植物受到损伤危害。涝害是世界上大多数国家面临的重大自然灾害之一[2]。据统计，我国黄淮平原以及长江中下游因为涝害所遭受的经济损失最
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严重，其受灾面积也达到了全国面积总和的3/4以上[3]。涝害由于水分含量过高导致植物体缺氧，无法正常的吸收营养和水分，从而对植物造成次生胁迫伤害。植物由于缺氧进行无氧呼吸所产生的代谢物均有一定的毒性，这些物质的累积进一步对植物根系等处产生毒害作用。同时由于植物吸收水分不足导致蒸腾作用减弱，光合作用也受到不利影响。在涝害逆境下，植物体通过提高渗透调剂物质、抗氧化保护机制等方面来适应涝害环境，增强其耐涝性。关于水分胁迫下作物耐涝性的研究要在细胞、形态、基因等各个方面不断的深入，研究植物在各个水平对涝害的响应方式，只有这样才能从根本上解决水分胁迫问题[4]。
1 材料与方法
1．1 试验材料与设计
1．1．1 试验材料
试验于江苏省南京市大学茶学研究所进行。试验品种为1年生“龙井长叶”茶苗，长势和大小基本一致（穴盘苗），由溧水茶园提供。2015年3月初，将茶苗移栽入口径25cm、高30cm的塑料花盆中，光照、水分管理养护一致。试验于3月29日正式展开。
1．1．2 涝害试验设计
以“龙井长叶”为试验材料，保持水淹状态，每天下午5：00用感量为1g的电子天平称量花盆的质量，持续处理21d后取茶苗23位叶测定各项指标。本试验采用完全随机试验设计，重复3次。
1．2 试验内容与方法
1．2．1 涝害胁迫对茶苗生理指标的影响
在涝害第21天上午8点取茶苗中上部成熟叶片并用锡箔纸包裹，用液氮速冻备用。参照王学奎[6]（2006）等方法进行测定，均使用UV2550紫外分光光度计。
（1）过氧化物酶（POD）活性测定
测定POD活性采用愈创木酚法。取植物叶片（去叶脉）0.25g于预冷的研钵中，1mL预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆（研磨时添加0.1 g PVP），加缓冲液至体积为5mL，于4000rpm下离心10min，取上清液。建立由2.9ml0.05 mol/L 磷酸缓冲液+1.0ml2%H2O2+1.0ml0.05 mol/L 愈创木酚组成的反应体系，对照为煮沸5min的酶液。在向上述反应体系中加入酶液之后，立即将其置于37℃温水中水浴保温15min，然后迅速转入冰水中进行冰浴，并加入2.0mL20%三氯乙酸溶液终止反应，然后以5000r/min的速度离心10min，在470nm波长下用紫外分光光度计测定吸光度，每20s读数一次，连续2min。
式中ΔA=反应时间内的吸光度变化；V1=提取酶液总体积（ml）；V2=测定时取用酶液体积（ml）；t=反应时间（min）；w=植物鲜重（g）
(2)超氧化物歧化酶（SOD）活性测定
采用氮蓝四唑（NBT）法测定。取0.25g茶树叶片（根据需要可去叶脉）放入预冷的研钵中，在冰浴的条件下加入1mL预冷的磷酸缓冲液将叶片研磨成浆（研磨时添加0.1gPVP），加缓冲液至体积为5mL，以4000rpm的速度离心10min，保留上清液。取1mL粗酶液稀释至10mL。
取5支透明度好的5mL指形管，以2支为对照管，另3支为测定管，在试管中加入1.5ml 0.05mol/l 磷酸缓冲液(pH7.8)+0.3ml 130mmol/L 甲硫氨酸溶液+ 0.3ml 750μmol/L NBT溶液 + 0.3ml100μmol/LEDTANa2溶液+ 0.3ml 20μmol/L核黄素溶液+ 0.2ml 蒸馏水，于一支对照管中加入0.1ml磷酸缓冲液，其余加入0.1ml酶提取液，各管混匀后将1支对照管置暗处，其它各管于4000 lx光照强度下反应20 min。以不照光的对照管做空白，至反应结束以后，分别测定其他各管的吸光度。
式中A1为照光的对照管吸光度；A2为样品管反应液吸光度值；V1为样液总体积（ml）；
V2为测定时样品用量（ml）；w为样品鲜重（g）
（3）可溶性糖含量的测定
采用蒽酮比色法测定。将蔗糖在80℃的条件下烘至质量恒定，精确称取1.000g，于少量水中溶解，转入100mL容量瓶中，加入0.5mL浓硫酸，用蒸馏水定容到刻度。再精确吸取1mL1%蔗糖标准液至100mL容量瓶中，定容，制为100μg/L 蔗糖液。取6支200mL刻度试管，编号05，按表1.1加入水和溶液。然后加入5mL浓硫酸和0.5蒽酮乙酸乙酯试剂，震荡充分后，在100℃水中进行水浴，每个试管保温1min，取出试管后自然冷却至室温，以空白作参比。在630nm下以紫外分光光度计测其吸光度，以糖含量和吸光度分别作为横坐标与纵坐标，绘制含糖量和吸光度的标准曲线，求出相应的线性方程。
表1.1 蒽酮法可溶性糖标准曲线各试剂加入量
Table 2.1 Standard curve of each soluble sugar reagent dosage of Anthrone
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