萝卜高频游离小孢子培养体系的建立
为能够提高萝卜游离小孢子胚诱导率，获得更多萝卜单倍体植株，本研究以20份萝卜种质为试验材料，在前人研究基础上，进一步优化萝卜小孢子培养体系，并对其再生植株的分生、生根培养条件进行了筛选与优化。本研究中，共10个基因型的小孢子经诱导，产生不同数量的胚状体，其中以基因型“Lw23”的成胚率最高，平均每个花蕾可诱导0.587个胚状体。低温4℃预处理1天，使用添加8%甘露醇的B5提取培养基，可有效提高小孢子胚诱导率；添加80 mg/L AC的培养基中小孢子悬浮前期培养于17%蔗糖浓度培养基（NLN-17）2d再更换新鲜的培养基（NLN-13）都能够在一定程度上促进小孢子胚发生；在18℃环境中，MS+3% Suc+ 0.10 mg/L NAA+0.1 mg/L IBA +0.7% Agar+0.25% AC，pH5.8或B5+3% Suc+ 0.10 mg/L NAA+0.1 mg/L IBA +0.7% Agar+0.25% AC，pH5.8为萝卜再生植株最佳的生根诱导培养条件。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 实验材料2
1.2 小孢子时期观察2
1.3 小孢子的分离及培养2
1.4 影响小孢子胚状体产量因素的研究2
1.4.1 基因型对胚状体发生的影响2
1.4.2 不同预处理对胚状体发生的影响2
1.4.3培养基的蔗糖浓度对胚状体发生的影响2
1.5 再生植株的继代培养2
1.5.1 分化培养基的筛选2
1.5.2 生根培养基的筛选3
1.6 统计分析3
2 结果与分析3
2.1 不同基因型胚芽发生能力不同3
2.2 适当预处理手段可提高胚芽发生率型胚芽发生能力不同4
2.3 培养基蔗糖浓度对成胚的影响5
2.4 筛选出最适的植株分化培养基6
2.5 筛选出最适的植株生根培养基6
3 讨论7
3.1 基因型对小孢子胚发生率的影响7
3 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
.2 预处理与胚状体诱导率7
3.3培养基蔗糖浓度与成胚诱导率8
致谢8
参考文献8
萝卜高频游离小孢子培养体系的建立
引言
引言
常规育种较单倍体育种所需年限长，且多代自交易出现经济性状退化等不良现象。另外由于单倍体只具有单套染色体组，经染色体加倍成双单倍体（double haploid，DH）后，与常规育种、分子生物学、基因工程的密切结合，可使作物育种发生革命性的变化[1]，因此，单倍体育种已成为现代育种一项重要的技术手段。游离小孢子培养是植物单倍体育种的重要手段之一。由于小孢子具有单倍体和单细胞两个方面的特点，所以小孢子培养除了在单倍体育种中具有优势之外，还是研究胚发生和形态发生机理较为理想的工具，同时也是遗传工程研究中极富吸引力的受体。
萝卜（Raphanus sativus L.）是我国人民长期栽培的主要根菜类作物，作为重要的起源地，我国萝卜种质资源十分丰富[2]。萝卜为十字花科中最不易进行游离小孢子培养的作物之一[3]。1996年 Yoshihito Takahara[4]首次成功报道萝卜游离小孢子培养，随后国内外也陆续有一些关于萝卜游离小孢子培养的研究报道[5]。但从目前的研究来看，萝卜小孢子培养胚状体诱导率较低，成胚基因型范围狭窄，植株再生困难等，严重限制了该技术在萝卜育种上的应用。本研究以试验室保存的萝卜种质为材料，在前人的基础上，进一步优化技术体系，旨在提高胚的诱导率和再生植株的能力，扩大出胚基因型范围，为萝卜小孢子培养高效体系的建立和新品种及转基因受体的获得奠定基础。
1 材料与方法
1．1 实验材料
试验材料为大学萝卜遗传育种实验室提供的20个萝卜种质，播种于大学园艺试验站，常规栽培管理直至抽薹开花。
1．2 小孢子时期观察
每次进行小孢子分离培养之前，对所选取试验品种材料进行小孢子时期的观察，以确定具有胚发生能力的花蕾长度。取长度24 mm的花蕾，分为四个长度等级：22.5 mm，2.53.0 mm，3.03.5mm和3.54mm。在显微镜下观察细胞形态结构，找出小孢子处于单核靠边期的花蕾长度范围，作为本次培养材料选择的标准。
1．3 小孢子的分离及培养
于天气晴朗的上午从健康的植株上选取主枝上长度约为2.5~3.5 mm花蕾，参照张翠萍（2009）[6]的方法，并略加优化。将所选取的完整花蕾放入70%的酒精中消毒30 s，随后采用7%浓度的次氯酸钠溶液对其表面进行消毒，1215 min后，无菌水冲洗、浸泡3次。将花蕾置于无菌研钵中，加入B5培养液，利用研杵轻轻挤压花蕾，使得小孢子
充分游离于培养液中，通过400目孔径的尼龙筛网过滤掉其他干扰花器官碎片，将含有小孢子的滤液经1000 r/min离心3 min，重复23次，最后一次离心后用NLN13培养液悬浮沉淀物，调整小孢子密度为1~2×105个/ml，并分装于6 cm直径的培养皿中，每皿23 ml，Parafilm密封，置于33℃的恒温箱中暗培养48 h后移至25℃暗培养。
1．4 影响小孢子胚状体产量因素的研究
1．4．1 基因型对胚状体发生的影响 对所选取的20种萝卜基因型材料进行游离小孢子培养，低温预处理时间为1d，培养于NLN13常规培养基中，经过热激处理后，培养于黑暗25℃环境中，待肉眼可见胚状体后进行统计。
1．4．2 不同预处理对胚状体发生的影响 对所选取的花蕾进行不同的预处理后，进行消毒、分离及培养，待一个月后统计不同预处理条件下获得的胚状体数量。预处理方式如下：
4℃低温预处理：处理时间分别设为0d、1d、2d和3d；
甘露醇预处理：处理浓度分别为0、4%、8%和12%
1．4．3 培养基的蔗糖浓度对胚状体发生的影响 将刚游离出的无菌小孢子经分离后，悬浮培养于NLN培养基中2d，其他培养条件不变，具体处理如下：
A：CK，小孢子一直培养于NLN13培养基中；
B：处理，前期将小孢子悬浮培养于含有17%蔗糖浓度的培养基中培养2d，其后重新离心（900r min1）更换培养基为常规蔗糖浓度的NLN13 培养基。
1．5 再生植株的继代培养
经过2~4周的暗培养后，将肉眼可见的胚状体转移到25℃、4000 LX、16 h/d的光照下培养一段时间，待胚状体转绿后接种到成苗培养基上，相同条件光照培养，一周后统计成活率。
1．5．1 分化培养基的筛选 将成活的材料接种于分化培养基（表1）中进行芽的诱导，筛选出最适的分化培养基激素比例。
表1 分化培养基中添加的激素配比浓度
Table 1 the compounding concentration of hormone in the differential medium
编号
Code
激素配比
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 实验材料2
1.2 小孢子时期观察2
1.3 小孢子的分离及培养2
1.4 影响小孢子胚状体产量因素的研究2
1.4.1 基因型对胚状体发生的影响2
1.4.2 不同预处理对胚状体发生的影响2
1.4.3培养基的蔗糖浓度对胚状体发生的影响2
1.5 再生植株的继代培养2
1.5.1 分化培养基的筛选2
1.5.2 生根培养基的筛选3
1.6 统计分析3
2 结果与分析3
2.1 不同基因型胚芽发生能力不同3
2.2 适当预处理手段可提高胚芽发生率型胚芽发生能力不同4
2.3 培养基蔗糖浓度对成胚的影响5
2.4 筛选出最适的植株分化培养基6
2.5 筛选出最适的植株生根培养基6
3 讨论7
3.1 基因型对小孢子胚发生率的影响7
3 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
.2 预处理与胚状体诱导率7
3.3培养基蔗糖浓度与成胚诱导率8
致谢8
参考文献8
萝卜高频游离小孢子培养体系的建立
引言
引言
常规育种较单倍体育种所需年限长，且多代自交易出现经济性状退化等不良现象。另外由于单倍体只具有单套染色体组，经染色体加倍成双单倍体（double haploid，DH）后，与常规育种、分子生物学、基因工程的密切结合，可使作物育种发生革命性的变化[1]，因此，单倍体育种已成为现代育种一项重要的技术手段。游离小孢子培养是植物单倍体育种的重要手段之一。由于小孢子具有单倍体和单细胞两个方面的特点，所以小孢子培养除了在单倍体育种中具有优势之外，还是研究胚发生和形态发生机理较为理想的工具，同时也是遗传工程研究中极富吸引力的受体。
萝卜（Raphanus sativus L.）是我国人民长期栽培的主要根菜类作物，作为重要的起源地，我国萝卜种质资源十分丰富[2]。萝卜为十字花科中最不易进行游离小孢子培养的作物之一[3]。1996年 Yoshihito Takahara[4]首次成功报道萝卜游离小孢子培养，随后国内外也陆续有一些关于萝卜游离小孢子培养的研究报道[5]。但从目前的研究来看，萝卜小孢子培养胚状体诱导率较低，成胚基因型范围狭窄，植株再生困难等，严重限制了该技术在萝卜育种上的应用。本研究以试验室保存的萝卜种质为材料，在前人的基础上，进一步优化技术体系，旨在提高胚的诱导率和再生植株的能力，扩大出胚基因型范围，为萝卜小孢子培养高效体系的建立和新品种及转基因受体的获得奠定基础。
1 材料与方法
1．1 实验材料
试验材料为大学萝卜遗传育种实验室提供的20个萝卜种质，播种于大学园艺试验站，常规栽培管理直至抽薹开花。
1．2 小孢子时期观察
每次进行小孢子分离培养之前，对所选取试验品种材料进行小孢子时期的观察，以确定具有胚发生能力的花蕾长度。取长度24 mm的花蕾，分为四个长度等级：22.5 mm，2.53.0 mm，3.03.5mm和3.54mm。在显微镜下观察细胞形态结构，找出小孢子处于单核靠边期的花蕾长度范围，作为本次培养材料选择的标准。
1．3 小孢子的分离及培养
于天气晴朗的上午从健康的植株上选取主枝上长度约为2.5~3.5 mm花蕾，参照张翠萍（2009）[6]的方法，并略加优化。将所选取的完整花蕾放入70%的酒精中消毒30 s，随后采用7%浓度的次氯酸钠溶液对其表面进行消毒，1215 min后，无菌水冲洗、浸泡3次。将花蕾置于无菌研钵中，加入B5培养液，利用研杵轻轻挤压花蕾，使得小孢子
充分游离于培养液中，通过400目孔径的尼龙筛网过滤掉其他干扰花器官碎片，将含有小孢子的滤液经1000 r/min离心3 min，重复23次，最后一次离心后用NLN13培养液悬浮沉淀物，调整小孢子密度为1~2×105个/ml，并分装于6 cm直径的培养皿中，每皿23 ml，Parafilm密封，置于33℃的恒温箱中暗培养48 h后移至25℃暗培养。
1．4 影响小孢子胚状体产量因素的研究
1．4．1 基因型对胚状体发生的影响 对所选取的20种萝卜基因型材料进行游离小孢子培养，低温预处理时间为1d，培养于NLN13常规培养基中，经过热激处理后，培养于黑暗25℃环境中，待肉眼可见胚状体后进行统计。
1．4．2 不同预处理对胚状体发生的影响 对所选取的花蕾进行不同的预处理后，进行消毒、分离及培养，待一个月后统计不同预处理条件下获得的胚状体数量。预处理方式如下：
4℃低温预处理：处理时间分别设为0d、1d、2d和3d；
甘露醇预处理：处理浓度分别为0、4%、8%和12%
1．4．3 培养基的蔗糖浓度对胚状体发生的影响 将刚游离出的无菌小孢子经分离后，悬浮培养于NLN培养基中2d，其他培养条件不变，具体处理如下：
A：CK，小孢子一直培养于NLN13培养基中；
B：处理，前期将小孢子悬浮培养于含有17%蔗糖浓度的培养基中培养2d，其后重新离心（900r min1）更换培养基为常规蔗糖浓度的NLN13 培养基。
1．5 再生植株的继代培养
经过2~4周的暗培养后，将肉眼可见的胚状体转移到25℃、4000 LX、16 h/d的光照下培养一段时间，待胚状体转绿后接种到成苗培养基上，相同条件光照培养，一周后统计成活率。
1．5．1 分化培养基的筛选 将成活的材料接种于分化培养基（表1）中进行芽的诱导，筛选出最适的分化培养基激素比例。
表1 分化培养基中添加的激素配比浓度
Table 1 the compounding concentration of hormone in the differential medium
编号
Code
激素配比
版权保护: 本文由 hbsrm.com编辑，转载请保留链接: www.hbsrm.com/nongxue/yy/338.html
