SCCL的水稻籽粒RVA特征值定位
目 录
1 引言 1
2 材料与方法 2
2.1 供试材料 2
2.2 试验设计 2
2.3 试验方法 2
2.4 操作步骤 3
2.5 统计分析3
3 结果与分析 4
3.1 亲本及CSSL群体的淀粉糊化特性4
3.2 RVA谱特征值及直链淀粉含量的相关性分析13
3.3 RVA谱特征值QTL定位 13
4 讨论12
结论 14
致谢 16
参考文献18
1 引言
影响稻米品质的因素有很多，其中稻米的直链淀粉含量一直被认为是决定其食味品质的最重要因子，但随着不断的深入研究，发现除了直链淀粉含量之外，稻米淀粉粘滞性谱也能反映米饭的适口性，从而反映水稻品质，它是水稻优质育种的重要理化指标[1]。稻米淀粉粘滞性谱（RVA谱）是用来测定稻米淀粉粘度特性的指标，它是指米粉在加热、高温和冷却过程中粘度随温度变化而形成的曲线，对应的特征值包括峰值粘度（PKV）、最低粘度(TPV)、最终粘度(FPV)、崩解值(BDV)、消减值(SBV)、峰值时间(PKT)和糊化温度(PT)等。
目前，国内外仅有少数研究者在做水稻RVA谱特征值的定位试验。Bao[2,3]等人利用4个初级分离群体作为研究对象，共检测到61个QTL与RVA谱特征值相关，检测到的QTL分布在水稻9条染色体上。Gravois[4,5]和Wan[6,7]认为水稻淀粉RVA谱表现的是典型的质量-数量性状，它的遗传变异主要受遗传主效应控制，同时基因型与环境互作效应也会对其产生一定的影响。这在一定程度上限制了RVA谱在选育优质水稻品种上的应用。而染色体 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
片段置换系在消除研究对象遗传背景干扰方面有不错的效果。它是进行QTL定位的良好材料。染色体片段置换系其实就是利用分子标记辅助选择技术建立的一套以同一个亲本为遗传背景，置换了供体亲本染色体片段的系列株系所组成的群体。在这些群体中，每个CSSL的基因组内都只有个别纯合的染色体片段是来自供体亲本，基因组的其他部分都与轮回亲本一样。因此，每个CSSL都是受体亲本的一个近等基因系，在CSSL与受体亲本之间的所有差异以及CSSL之间的所有可遗传的变异都与置换片段相联系，这些都暗示着在这些片段内可能存在QTL[8]。
基于高密度分子连锁图谱的数量性状位点（QTL）分析是一个揭开复杂性状的基因型的强有力的手段。所谓的QTL定位是通过DNA标记和数量性状之间的关系的分析，逐一将QTL定位到染色体的对应位置上，并估计其遗传效应的来源。定位QTL的方法有很多，但是这些方法的遗传原理却是相同的，即当DNA标记与数量性状的某个QTL 连锁，那么不同标记基因型个体的表型值将存在显著差异。换句话说，如果连锁发生，那么就会存在QTL。QTL分析就是在连锁发生的基础而进行的[9]。
在这项研究中，我们采用一种先进的回交群体-染色体片段置换系（CSSL）进行水稻籽粒RVA谱特征值的QTL定位。
2 材料与方法
2.1 供试群体
本试验的受体亲本为9311，供体亲本为日本晴，以这两个品种的水稻构建CSSL，首先得到BC4F1群体。然后使用250个SSR标记和STS标记（这些标记覆盖水稻全基因组且亲本间具有多态性）来检测BC4F1单株的基因型，选择含有少量杂合片段单株的种子继续种植，得到BC4F2群体。对BC4F2群体中单株基因型进行检测，获得119个纯合的染色体片段置换系，即为本研究的试验材料。置换片段的总长度(去除重叠片段)为1202 cm，占染色体总长度的比例约为78.6％。所有分子标记以物理距离（Mb）为单位。利用染色体图谱对CSSL中的置换片段进行全基因组检测。
2.2 试验设计
将119个CSSLs及亲本9311和日本晴2012年和2013年连续2年种植于江苏省农业科学院南京本部试验基地（南京，32°02’N，118°52’E，elev.10m）。两年的种植都是在5月15日播种，6月20日移栽。按照随机区组设计种植，共种植2个区组。每个区组包括119个株系和2个亲本。每个小区3行，每行10株，株行距为16.6×26.6cm，所有水稻均采用常规肥水管理。为了避免边际效应，成熟后每个小区取中间5株为样本，自然晾干后用旋风式磨粉机碾磨成米粉，然后过100目筛，再放入40℃烘箱烘干，室温下平衡2天后放入4℃冰箱备用。
2.3 试验方法
淀粉糊化特性的测定采用的是瑞典波通仪器公司的RVA快速粘度分析仪techmaster，并配套软件TCW。只要把磨好的米粉放入罐中并按下塔帽，一定时间后电脑就会显示RVA图谱以及相关数据。目前已在谷物和淀粉粘度测定方面得到了广泛应用[10-13]。这款粘度分析仪器具有控温程序的旋转型粘度测定仪，并且带有程序升温装置和可变的剪切力，可以优化条件，使检测淀粉、谷物、面粉和食品的粘度特性的环境达到最佳。RVA谱的测定按照国标GB/T 24852-2010[中华人民共和国国家标准.大米及米粉糊化特性测定快速粘度仪法.G *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
B/T 24852-2010.北京:中国标准出版社,2010]。
其操作规程为：含水量为14.0，样品重3.00g，蒸馏水25.0ml。在整个测定过程中铝罐内温度不断变化，变化规律如下：50℃保持1min，以12℃/min上升到95℃（3.75min），95℃保持2.5min，以12℃/min下降到50℃（3.75min），50℃保持1.4min。桨叶在起始10s内转速为960r/min，以后转速维持在160r/min。试验测得的RVA谱特征值有峰值黏度（Peak viscosity, PKV），最低黏度（Trough viscosity，TPV），最终黏度（Final Visc, FPV）、崩解值（Breakdown, BDV），消减值（Setback，SBV）、峰值时间（Peak Time，PKT）和糊化温度（Pasting Temp，PT）等。在样本测定之前要进行仪器校准，使用仪器标配的标准样品进行校准。标样重量3.50±0.01g，其余步骤与样品测定过程相同。
2.4 操作步骤
1、打开冷却水，开启RVA，预热30分钟。将连接的计算机打开，运行RVA控制软件。连接成功后，下方状态显示空闲。
2、点击运行，打开编辑测试程序，选择rice-rapid-rvc，为了方便数据的保存，一般要输入文件名。
3、称量蒸馏水25.00±0.01ml，移入铝罐中。
4、用分析天平称取已经磨好的粉碎的大米试样3.00±0.01g,并转移倒入到铝罐内。
5、用桨叶在罐中剧烈地上下搅动10次，如果水面上仍有未溶解的团块或有米粉粘附在桨叶上，可重复操作此步骤。
6、将铝罐插接到仪器上：
A、?桨叶上有两个相对的凹陷处，旋转桨叶，直至凹陷处正面朝向试验者。?
B、?桨叶完全插入到小罐中后，倾斜桨叶的顶端进入耦合处，用力在耦合处的背面下压，以保证浆叶处于正确的位置。?
C、慢慢旋转铝罐，当桨叶与铝罐壁无摩擦时则连接成功。
1 引言 1
2 材料与方法 2
2.1 供试材料 2
2.2 试验设计 2
2.3 试验方法 2
2.4 操作步骤 3
2.5 统计分析3
3 结果与分析 4
3.1 亲本及CSSL群体的淀粉糊化特性4
3.2 RVA谱特征值及直链淀粉含量的相关性分析13
3.3 RVA谱特征值QTL定位 13
4 讨论12
结论 14
致谢 16
参考文献18
1 引言
影响稻米品质的因素有很多，其中稻米的直链淀粉含量一直被认为是决定其食味品质的最重要因子，但随着不断的深入研究，发现除了直链淀粉含量之外，稻米淀粉粘滞性谱也能反映米饭的适口性，从而反映水稻品质，它是水稻优质育种的重要理化指标[1]。稻米淀粉粘滞性谱（RVA谱）是用来测定稻米淀粉粘度特性的指标，它是指米粉在加热、高温和冷却过程中粘度随温度变化而形成的曲线，对应的特征值包括峰值粘度（PKV）、最低粘度(TPV)、最终粘度(FPV)、崩解值(BDV)、消减值(SBV)、峰值时间(PKT)和糊化温度(PT)等。
目前，国内外仅有少数研究者在做水稻RVA谱特征值的定位试验。Bao[2,3]等人利用4个初级分离群体作为研究对象，共检测到61个QTL与RVA谱特征值相关，检测到的QTL分布在水稻9条染色体上。Gravois[4,5]和Wan[6,7]认为水稻淀粉RVA谱表现的是典型的质量-数量性状，它的遗传变异主要受遗传主效应控制，同时基因型与环境互作效应也会对其产生一定的影响。这在一定程度上限制了RVA谱在选育优质水稻品种上的应用。而染色体 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
片段置换系在消除研究对象遗传背景干扰方面有不错的效果。它是进行QTL定位的良好材料。染色体片段置换系其实就是利用分子标记辅助选择技术建立的一套以同一个亲本为遗传背景，置换了供体亲本染色体片段的系列株系所组成的群体。在这些群体中，每个CSSL的基因组内都只有个别纯合的染色体片段是来自供体亲本，基因组的其他部分都与轮回亲本一样。因此，每个CSSL都是受体亲本的一个近等基因系，在CSSL与受体亲本之间的所有差异以及CSSL之间的所有可遗传的变异都与置换片段相联系，这些都暗示着在这些片段内可能存在QTL[8]。
基于高密度分子连锁图谱的数量性状位点（QTL）分析是一个揭开复杂性状的基因型的强有力的手段。所谓的QTL定位是通过DNA标记和数量性状之间的关系的分析，逐一将QTL定位到染色体的对应位置上，并估计其遗传效应的来源。定位QTL的方法有很多，但是这些方法的遗传原理却是相同的，即当DNA标记与数量性状的某个QTL 连锁，那么不同标记基因型个体的表型值将存在显著差异。换句话说，如果连锁发生，那么就会存在QTL。QTL分析就是在连锁发生的基础而进行的[9]。
在这项研究中，我们采用一种先进的回交群体-染色体片段置换系（CSSL）进行水稻籽粒RVA谱特征值的QTL定位。
2 材料与方法
2.1 供试群体
本试验的受体亲本为9311，供体亲本为日本晴，以这两个品种的水稻构建CSSL，首先得到BC4F1群体。然后使用250个SSR标记和STS标记（这些标记覆盖水稻全基因组且亲本间具有多态性）来检测BC4F1单株的基因型，选择含有少量杂合片段单株的种子继续种植，得到BC4F2群体。对BC4F2群体中单株基因型进行检测，获得119个纯合的染色体片段置换系，即为本研究的试验材料。置换片段的总长度(去除重叠片段)为1202 cm，占染色体总长度的比例约为78.6％。所有分子标记以物理距离（Mb）为单位。利用染色体图谱对CSSL中的置换片段进行全基因组检测。
2.2 试验设计
将119个CSSLs及亲本9311和日本晴2012年和2013年连续2年种植于江苏省农业科学院南京本部试验基地（南京，32°02’N，118°52’E，elev.10m）。两年的种植都是在5月15日播种，6月20日移栽。按照随机区组设计种植，共种植2个区组。每个区组包括119个株系和2个亲本。每个小区3行，每行10株，株行距为16.6×26.6cm，所有水稻均采用常规肥水管理。为了避免边际效应，成熟后每个小区取中间5株为样本，自然晾干后用旋风式磨粉机碾磨成米粉，然后过100目筛，再放入40℃烘箱烘干，室温下平衡2天后放入4℃冰箱备用。
2.3 试验方法
淀粉糊化特性的测定采用的是瑞典波通仪器公司的RVA快速粘度分析仪techmaster，并配套软件TCW。只要把磨好的米粉放入罐中并按下塔帽，一定时间后电脑就会显示RVA图谱以及相关数据。目前已在谷物和淀粉粘度测定方面得到了广泛应用[10-13]。这款粘度分析仪器具有控温程序的旋转型粘度测定仪，并且带有程序升温装置和可变的剪切力，可以优化条件，使检测淀粉、谷物、面粉和食品的粘度特性的环境达到最佳。RVA谱的测定按照国标GB/T 24852-2010[中华人民共和国国家标准.大米及米粉糊化特性测定快速粘度仪法.G *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
B/T 24852-2010.北京:中国标准出版社,2010]。
其操作规程为：含水量为14.0，样品重3.00g，蒸馏水25.0ml。在整个测定过程中铝罐内温度不断变化，变化规律如下：50℃保持1min，以12℃/min上升到95℃（3.75min），95℃保持2.5min，以12℃/min下降到50℃（3.75min），50℃保持1.4min。桨叶在起始10s内转速为960r/min，以后转速维持在160r/min。试验测得的RVA谱特征值有峰值黏度（Peak viscosity, PKV），最低黏度（Trough viscosity，TPV），最终黏度（Final Visc, FPV）、崩解值（Breakdown, BDV），消减值（Setback，SBV）、峰值时间（Peak Time，PKT）和糊化温度（Pasting Temp，PT）等。在样本测定之前要进行仪器校准，使用仪器标配的标准样品进行校准。标样重量3.50±0.01g，其余步骤与样品测定过程相同。
2.4 操作步骤
1、打开冷却水，开启RVA，预热30分钟。将连接的计算机打开，运行RVA控制软件。连接成功后，下方状态显示空闲。
2、点击运行，打开编辑测试程序，选择rice-rapid-rvc，为了方便数据的保存，一般要输入文件名。
3、称量蒸馏水25.00±0.01ml，移入铝罐中。
4、用分析天平称取已经磨好的粉碎的大米试样3.00±0.01g,并转移倒入到铝罐内。
5、用桨叶在罐中剧烈地上下搅动10次，如果水面上仍有未溶解的团块或有米粉粘附在桨叶上，可重复操作此步骤。
6、将铝罐插接到仪器上：
A、?桨叶上有两个相对的凹陷处，旋转桨叶，直至凹陷处正面朝向试验者。?
B、?桨叶完全插入到小罐中后，倾斜桨叶的顶端进入耦合处，用力在耦合处的背面下压，以保证浆叶处于正确的位置。?
C、慢慢旋转铝罐，当桨叶与铝罐壁无摩擦时则连接成功。
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