通过rna干扰（rnai)增强植物黄瓜绿斑驳花叶病毒(cgmmv)抗性的研究
摘要：RNA沉默现象是由于双链RNA高效特异性地阻断了相应基因的表达，即RNA干扰（RNAi)。RNAi现象主要通过小RNA介导，普遍存在于植物对病毒侵害的抵御机制中。当病毒基因侵入植物细胞的时候，植物细胞内的DCL酶将病毒复制产生的双链RNA或单链RNA二级结构中形成的双链部分，切割成20-25 nt长度的siRNA。这些siRNA与AGO等蛋白结合组成RNA诱导的沉默复合物，从而指导靶标RNA即同源病毒基因的切割与降解。siRNA是RNA干扰机制的重要组成部分。本研究通过分析近年来测得的黄瓜绿斑驳花叶病毒的序列，找出它们的保守序列作为靶标，设计RNA干扰载体，在验证中进行转基因，以验证这些靶位点对增强植物植物黄瓜绿斑驳花叶病毒抗性的作用，从而为建立增强葫芦及其他作物对CGMMV的抗性的RNAi最佳方案。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1研究方法3
1.1 CGMMV基因组序列保守性分析 3
1.2有效siRNAs 预测3
1.3构建Replicase、MP、CP、及三者融合R&M&C的RNAi载体 3
1.4转基因步骤4
1.4.1 组织培养使用的材料和器材材4
1.4.2 组织培养步骤4
2 结果与分析5
2.1 CGMMV基因组序列保守性分析及RNAi靶序列选择5
2.2 RNAi靶序列选择及可能产生有效siRNAs的预测 7
2.3 RNAi载体构建及转基因植物构建9
2.4 构建转基因烟草9
3讨论11
致谢12
参考文献13
通过RNA干扰（RNAi）增强植物黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)抗性的研究
引言
引言
RNA沉默现象最早是在对矮牵牛的花色研究中发现，Napoli等[29]将一个能够产生色素的基因转入到矮牵牛中，但却发现植物中的同源基因和导入的基因出现了共抑制（cosuppression）现象，并且产生了白色的花。之后，Fire等[12]在对秀丽新小杆线虫
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
的研究中发现是由双链RNA（doublestrand RNA, dsRNA）高效特异性地阻断了相应基因的表达，并针对这一现象提出了RNA干扰（RNA interference, RNAi）的概念。随后，这一现象在动物、植物、真菌中均有发现。
在植物病毒病的研究中，最早Lindbo等[22]将烟草蚀刻病毒（TEV）的衣壳蛋白基因直接转入烟草，获得了对该病毒具有抗性的植株，随后发现抗性的产生与转录后沉默有关，RNAi概念提出后发现这也是由于RNAi引起的。此后许多研究者利用RNAi原理构建抗病毒转基因植株，Waterhouse等[30]向植株中同时转入正向和反向两条RNA分子，或者是一条可以自行回折形成双股RNA的分子，在复制过程中形成的双链RNA直接诱导植株产生了对马铃薯Y病毒（PVY）的抗性。Yang等[31]将番茄黄化曲叶（TYLCV）的复制酶基因的不同片段分别正向、反向或者一段正向加一段反向序列融合后连入载体后导入番茄植株，获得了对该病毒具有抗性的R0代和R1代番茄植株。Lin等[21]利用该原理将三种病毒的CP基因片段相融合再转入西瓜，R0代西瓜具有对这三种病毒的抗性，并可在R1代转基因植株中检测到由CP基因产生的小片段RNA。
RNAi现象不仅在抗病毒转基因植物中存在，在植物自身对病毒的抵抗中也普遍存在。Martinez等[25]利用高通量测序技术在受到啤酒花矮化类病毒（HSVd）侵染的黄瓜叶片和维管束中检测到大量来源于病毒基因组的21 nt和22 nt的小片段RNA。大量研究均表明，RNA沉默是植物抵御病毒侵染的主要机制之一[9]。在这种植物和病毒的相互作用的过程中，病毒也逐渐演化出了应对宿主植物这种沉默反应的反防御机制，即产生沉默抑制子来抑制植物的RNA沉默作用，这从另一个角度证明了RNA沉默在植物对病毒的防御过程中起到了重要作用。
植物利用RNA沉默抵御病毒侵染主要通过小RNA介导来实现的。当病毒基因侵入植物细胞的时候，病毒复制产生的双链RNA或单链RNA二级结构中形成的双链部分，会被植物细胞内的DCL酶（Dicerlike, DCL）切割成2025 nt长度的siRNA（small interfere RNA）。这些siRNA与AGO等蛋白结合组成RNA诱导的沉默复合物（RNAinduced silencing complexes, RISC），从而指导靶标RNA即同源病毒基因的切割与降解[9]。此外，还有研究认为一些病毒源siRNA（vsiRNA）也可以靶向宿主的转录本，引起部分宿主基因在转录后表达水平的改变[1][5]。DCL酶切割产生的siRNA除了介导同源基因的切割外，还可以作为引物在RDR聚合酶（RNA dependent RNA polymerase, RDRP）的作用下转录靶标RNA生成次级dsRNA（doublestranded RNA），进而在DCL的切割作用下产生更多的次级siRNA，起到放大转录后沉默信号，增强沉默效应的作用。同时，植物自身也会诱导产生一些内源性小RNA来调控自身基因表达，以应对病毒的侵染。现在，对RNA沉默机制的研究，已经成为植物分子生物学的一个新的研究方向，并且具有非常广阔的应用前景。在许多研究中利用这种RNAi原理，通过在植物中过表达病毒基因片段，来赋予或增强植物对该种病毒的抗性[3][18][21]。
植物RNA沉默的显著特征是产生的具有序列特异性的具调控功能的小RNA作为主要信号分子。Hamilton等[15]在发生转录后沉默的西红柿中检测出与被沉默基因同源的约25 nt的短片段RNA，而未发生转录后沉默的西红柿则不能检出这些小片段RNA。Zamore等[32]也证明siRNA是RNA干扰机制的重要组成部分。在被病毒侵染的植株中可以检测到大量vsiRNA。对病毒侵染的植物宿主细胞中存在的siRNA的研究，不仅可以表明宿主的RNA沉默机制可以靶向病毒RNA，随着高通量测序技术的发展，还使得这些siRNAs的起源、组成以及它们对基因表达的调控方式也逐渐被揭示。在植物受病毒侵染后，检测其中的小分子RNA时发现，不同的病毒与宿主作用过程中主要产生的siRNA的大小是不同的。有的病毒会诱导产生2122 nt的小RNA，而另外一种病毒可能会诱导产生2324 nt的小RNA。Deleris等[8]认为，产生这种差别的原因可能与DCL的丰度及病毒抑制蛋白作用于DCL指导的沉默方式有关。因此，不同的病毒和寄主植物诱导产生不同的小RNA作为信号分子，所以目前对于病毒和宿主植物互作时产生的siRNA的特性、产生途径及功能的鉴定等方面的研究已成为揭示RNA介导的病毒免疫机理的重点环节。
本研究欲通过比对分析目前已报道的不同CGMMV株系的基因组序列进行比对，分析序列保守区域，选择CGMMV的不同基因序列作为RNAi的靶序列，为比较转基因烟草对CGMMV抗性的差异，选择出最有效的病毒靶基因进行RNAi,从而建立增强烟草及其他作物对CGMMV的抗性的RNAi最佳方案。
1 研究方法
1．1 CGMMV基因组序列保守性分析
从NCBI中获取目前已测序的不同CGMMV株系的全序列，使用MEGA 4.0及Vector NTI 11进行序列比对、系谱树构建及相似性和保守区域分析。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1研究方法3
1.1 CGMMV基因组序列保守性分析 3
1.2有效siRNAs 预测3
1.3构建Replicase、MP、CP、及三者融合R&M&C的RNAi载体 3
1.4转基因步骤4
1.4.1 组织培养使用的材料和器材材4
1.4.2 组织培养步骤4
2 结果与分析5
2.1 CGMMV基因组序列保守性分析及RNAi靶序列选择5
2.2 RNAi靶序列选择及可能产生有效siRNAs的预测 7
2.3 RNAi载体构建及转基因植物构建9
2.4 构建转基因烟草9
3讨论11
致谢12
参考文献13
通过RNA干扰（RNAi）增强植物黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)抗性的研究
引言
引言
RNA沉默现象最早是在对矮牵牛的花色研究中发现，Napoli等[29]将一个能够产生色素的基因转入到矮牵牛中，但却发现植物中的同源基因和导入的基因出现了共抑制（cosuppression）现象，并且产生了白色的花。之后，Fire等[12]在对秀丽新小杆线虫
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
的研究中发现是由双链RNA（doublestrand RNA, dsRNA）高效特异性地阻断了相应基因的表达，并针对这一现象提出了RNA干扰（RNA interference, RNAi）的概念。随后，这一现象在动物、植物、真菌中均有发现。
在植物病毒病的研究中，最早Lindbo等[22]将烟草蚀刻病毒（TEV）的衣壳蛋白基因直接转入烟草，获得了对该病毒具有抗性的植株，随后发现抗性的产生与转录后沉默有关，RNAi概念提出后发现这也是由于RNAi引起的。此后许多研究者利用RNAi原理构建抗病毒转基因植株，Waterhouse等[30]向植株中同时转入正向和反向两条RNA分子，或者是一条可以自行回折形成双股RNA的分子，在复制过程中形成的双链RNA直接诱导植株产生了对马铃薯Y病毒（PVY）的抗性。Yang等[31]将番茄黄化曲叶（TYLCV）的复制酶基因的不同片段分别正向、反向或者一段正向加一段反向序列融合后连入载体后导入番茄植株，获得了对该病毒具有抗性的R0代和R1代番茄植株。Lin等[21]利用该原理将三种病毒的CP基因片段相融合再转入西瓜，R0代西瓜具有对这三种病毒的抗性，并可在R1代转基因植株中检测到由CP基因产生的小片段RNA。
RNAi现象不仅在抗病毒转基因植物中存在，在植物自身对病毒的抵抗中也普遍存在。Martinez等[25]利用高通量测序技术在受到啤酒花矮化类病毒（HSVd）侵染的黄瓜叶片和维管束中检测到大量来源于病毒基因组的21 nt和22 nt的小片段RNA。大量研究均表明，RNA沉默是植物抵御病毒侵染的主要机制之一[9]。在这种植物和病毒的相互作用的过程中，病毒也逐渐演化出了应对宿主植物这种沉默反应的反防御机制，即产生沉默抑制子来抑制植物的RNA沉默作用，这从另一个角度证明了RNA沉默在植物对病毒的防御过程中起到了重要作用。
植物利用RNA沉默抵御病毒侵染主要通过小RNA介导来实现的。当病毒基因侵入植物细胞的时候，病毒复制产生的双链RNA或单链RNA二级结构中形成的双链部分，会被植物细胞内的DCL酶（Dicerlike, DCL）切割成2025 nt长度的siRNA（small interfere RNA）。这些siRNA与AGO等蛋白结合组成RNA诱导的沉默复合物（RNAinduced silencing complexes, RISC），从而指导靶标RNA即同源病毒基因的切割与降解[9]。此外，还有研究认为一些病毒源siRNA（vsiRNA）也可以靶向宿主的转录本，引起部分宿主基因在转录后表达水平的改变[1][5]。DCL酶切割产生的siRNA除了介导同源基因的切割外，还可以作为引物在RDR聚合酶（RNA dependent RNA polymerase, RDRP）的作用下转录靶标RNA生成次级dsRNA（doublestranded RNA），进而在DCL的切割作用下产生更多的次级siRNA，起到放大转录后沉默信号，增强沉默效应的作用。同时，植物自身也会诱导产生一些内源性小RNA来调控自身基因表达，以应对病毒的侵染。现在，对RNA沉默机制的研究，已经成为植物分子生物学的一个新的研究方向，并且具有非常广阔的应用前景。在许多研究中利用这种RNAi原理，通过在植物中过表达病毒基因片段，来赋予或增强植物对该种病毒的抗性[3][18][21]。
植物RNA沉默的显著特征是产生的具有序列特异性的具调控功能的小RNA作为主要信号分子。Hamilton等[15]在发生转录后沉默的西红柿中检测出与被沉默基因同源的约25 nt的短片段RNA，而未发生转录后沉默的西红柿则不能检出这些小片段RNA。Zamore等[32]也证明siRNA是RNA干扰机制的重要组成部分。在被病毒侵染的植株中可以检测到大量vsiRNA。对病毒侵染的植物宿主细胞中存在的siRNA的研究，不仅可以表明宿主的RNA沉默机制可以靶向病毒RNA，随着高通量测序技术的发展，还使得这些siRNAs的起源、组成以及它们对基因表达的调控方式也逐渐被揭示。在植物受病毒侵染后，检测其中的小分子RNA时发现，不同的病毒与宿主作用过程中主要产生的siRNA的大小是不同的。有的病毒会诱导产生2122 nt的小RNA，而另外一种病毒可能会诱导产生2324 nt的小RNA。Deleris等[8]认为，产生这种差别的原因可能与DCL的丰度及病毒抑制蛋白作用于DCL指导的沉默方式有关。因此，不同的病毒和寄主植物诱导产生不同的小RNA作为信号分子，所以目前对于病毒和宿主植物互作时产生的siRNA的特性、产生途径及功能的鉴定等方面的研究已成为揭示RNA介导的病毒免疫机理的重点环节。
本研究欲通过比对分析目前已报道的不同CGMMV株系的基因组序列进行比对，分析序列保守区域，选择CGMMV的不同基因序列作为RNAi的靶序列，为比较转基因烟草对CGMMV抗性的差异，选择出最有效的病毒靶基因进行RNAi,从而建立增强烟草及其他作物对CGMMV的抗性的RNAi最佳方案。
1 研究方法
1．1 CGMMV基因组序列保守性分析
从NCBI中获取目前已测序的不同CGMMV株系的全序列，使用MEGA 4.0及Vector NTI 11进行序列比对、系谱树构建及相似性和保守区域分析。
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