洋葱四倍体离体诱导方法的研究
摘要：多倍体植物由于染色体的加倍，产品的营养器官具有巨大性，营养成份含量高及杭逆性强等优异特性，多倍体育种可以大大增强作物的营养价值和商品价值。洋葱以营养器官肉质鳞茎为产品，其多倍体育种在洋葱育种上具有重要意义，另外可以提供更多的种质资源。本实验采用三种不同浓度的秋水仙素，洋葱对不同秋水仙素处理浓度和处理时问的反应小同，秋水仙素对洋葱四倍体的诱变效应亦存在显著差异，但均以处理浓度的影响大于处理时问，且处理浓度与处理时问存在互作效应。获得了四倍体植株，为洋葱多倍体诱导提供了技术支持。通过比较四倍体植株与二倍体植株生长发育和生理生化特性来判断四倍体性状。
目录
摘要2
关键词2
Abstract2
Key words2
引言23
1材料与方法34
1.1实验材料 3
1.2实验方法及步骤 34
1.3多倍体的鉴定 4
2结果与分析56
2.1秋水仙素对鳞茎生长点的影响5
2.2再生苗的获得5
2.3多倍体植株的获得与鉴定56
3.讨论6
致谢7
参考文献7
洋葱四倍体离体诱导方法研究
引言
引言 洋葱(Allium cepa L) 别名葱头、圆葱。百合科葱属植物中以肉质鳞片和鳞芽构成鳞茎，已有五千多年的栽培历史, 洋葱由地中海传入中国，我国洋葱的栽培历史很短，但近年来栽培面积发展迅速，现已成为洋葱生产的第一大国，洋葱也已成为我国主要的出口创汇蔬菜之一。 洋葱以地下鳞茎入蔬。是享誉全球的保健食品之一，被欧美誉为 “菜中皇后”。洋葱亦是典型的异花授粉二年生草本植物。其育种上存在周期长、效率低、自交退化严重等特点。而多倍体植物在新开放或相对不稳定的环境中具有更强的生存能力和更大的生理生化灵活性，比二倍体祖先或近缘种更能耐受恶劣环境，在营养繁殖和多年生植物中具有明显的优势[1]。
自Blakeslee和Avery[2] ( 1937)开创倍性育种先河以来，全球掀起了多倍体育种热潮。大量研究表明，多倍体诱导是创造变异的有效手段，而多倍体材料往往表现为部分器官增大、产量提高，甚至还具有抗逆性增强等
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优点。化学诱变是多倍体诱导普遍采用的方法，而秋水仙素是被广泛采用且最有效的药剂，其对材料染色体的结构并无显著影响，在遗传上很少发生其他不利的变异[3]。随着植物组织培养技术的日趋成熟，在传统的化学诱导基础上，通过组织培养结合秋水仙素诱导诱导植物多倍体的技术手段得以发展。越来越多的植物建立了组织培养再生体系，使得秋水仙素在离体水平上诱导细胞内染色体加倍成为可能[4](谭德冠等，2005)。
Phillips和Luteyn [5]以萌发的种子为外植体,获得了体细胞胚,但是诱导率较低,只有7%。Saker [6]以成熟种子为外植体,在MS培养基上添加2 mg/L的 2,4D获得胚性愈伤组织,添加1 mg/L的 KT的培养基上培养,愈伤组织表面上产生体细胞胚并获得再生苗。姜聰琰[7]用洋葱花蕾为外植体,在 2 mg* L12，4D + 2 mg* L1 6BA + 1 mg* L1KT + 0.5 mg* L1NAA的MS培养基上,愈伤组织的最高诱导率为41.11%,培养得到了胚性愈伤组织和胚状体,获得了洋葱再生植株。
孔红等人研究非洲凤仙发现，在0.2%秋水仙素作用下，四倍体诱导率随处理时间的增加而增大，0. 5%浓度处理的诱导率均达15%，但处理72 h时死亡率高达30%。因此，在0. 5%浓度，48 h条件下诱导效果最好[8]。
黄永莲等（2005）研究表明，0.05%的秋水仙素诱导产生双核比其它浓度明显，浓度越高产生的多核细胞就越明显;而0.1%浓度则诱导产生微核细胞比较明显。秋水仙素诱发变异的最佳处理时问一般在24 48h之后，这时的染色体变异和细胞畸变频率最高[9]。张素芝和李纪蓉(2006)研究表明，25. 30℃时短时间处理的诱导率明显高于4℃低温处理，但处理时间较长时4℃低温也有较高的诱导率[10]。
相关研穷表明，以气生鳞茎为外植体的大蒜愈伤组织途径或不定芽途径的组织培养再生体系均可获得染色体加倍效果[11]（马雯等，2011）。董飞等(2011)以大葱种子为处理材料，发现0.8%的秋水仙素浸泡处理48h，组织培养变异幼苗去玻璃化，获得了正常生长的四倍体植株[12]。另外还有关于物理诱导法、有性杂交、原生质体培养、体细胞融合等洋葱细胞培养的研究报道[1319]。
多倍体植物在新开放或相对不稳定的环境中具有更强的生存能力和更大的生理生化灵活性，比二倍体祖先或近缘种更能耐受恶劣环境，在营养繁殖和多年生植物中具有明显的优势[3]。
1 材料与方法
1.1材料
（1）药品试剂。秋水仙碱、BDS培养基 、6苄氨基腺嘌呤（6BA）、萘乙酸（NAA）、二甲基亚砜（DMSO）、酒精、次氯酸钠溶液、多菌灵。
（2）试剂配制。1%的秋水仙碱母液：称1g秋水仙素碱，溶解在2%二甲基亚砜（DMSO）中，再加蒸馏水稀释至100ml。
（3）洋葱。供试材料为W470，由大学园艺站提供，实验在大学作物遗传与种质创新国家重点实验室组培室进行。
（4）基础培养基。均使用固体BDS培养基为基本培养基，添加不同的植物激素，蔗糖3%，琼脂0.75%，调pH值至5.75.8。
1.2 实验方法及步骤
（1）技术路线
洋葱材料 消毒 取其鳞茎盘 加诱导剂培养 发芽培养 生根培养 培养成苗 检测倍性
（2）实验方案：
1）前期处理
将冷藏洋葱球拨出外皮至直径为23cm，用自来水洗干净，拿至超净工作台，用75%酒精浸泡1min（摇晃），再用无菌水冲洗5次后，再次将外皮剥尽，留下鳞茎盘，用10%次氯酸钠溶液浸泡15min，无菌水冲洗5次，无菌滤纸吸干水分，在无菌条件下用消过毒的手术刀将洋葱切除至鳞茎盘为1~2cm厚、贴近鳞茎盘的鳞茎长、宽各为4~5mm、高为1.0~1.5mm做带有一个肉眼可观的芽眼外植体。
2）加秋水仙素培养
固体培养基：转入含有秋水仙素碱浓度分别为0、0.010%、0.015%、0.020%的愈伤组织诱导培养基（BDS+0.35mg/L NAA+0.9mg/L6BA）中，处理时间分别为24h、48h，共8个组合，每个组合100粒洋葱鳞茎盘。培养温度（22+/1）℃，光照强度2000lx，光照时14h/d,RH为90%。
目录
摘要2
关键词2
Abstract2
Key words2
引言23
1材料与方法34
1.1实验材料 3
1.2实验方法及步骤 34
1.3多倍体的鉴定 4
2结果与分析56
2.1秋水仙素对鳞茎生长点的影响5
2.2再生苗的获得5
2.3多倍体植株的获得与鉴定56
3.讨论6
致谢7
参考文献7
洋葱四倍体离体诱导方法研究
引言
引言 洋葱(Allium cepa L) 别名葱头、圆葱。百合科葱属植物中以肉质鳞片和鳞芽构成鳞茎，已有五千多年的栽培历史, 洋葱由地中海传入中国，我国洋葱的栽培历史很短，但近年来栽培面积发展迅速，现已成为洋葱生产的第一大国，洋葱也已成为我国主要的出口创汇蔬菜之一。 洋葱以地下鳞茎入蔬。是享誉全球的保健食品之一，被欧美誉为 “菜中皇后”。洋葱亦是典型的异花授粉二年生草本植物。其育种上存在周期长、效率低、自交退化严重等特点。而多倍体植物在新开放或相对不稳定的环境中具有更强的生存能力和更大的生理生化灵活性，比二倍体祖先或近缘种更能耐受恶劣环境，在营养繁殖和多年生植物中具有明显的优势[1]。
自Blakeslee和Avery[2] ( 1937)开创倍性育种先河以来，全球掀起了多倍体育种热潮。大量研究表明，多倍体诱导是创造变异的有效手段，而多倍体材料往往表现为部分器官增大、产量提高，甚至还具有抗逆性增强等
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
优点。化学诱变是多倍体诱导普遍采用的方法，而秋水仙素是被广泛采用且最有效的药剂，其对材料染色体的结构并无显著影响，在遗传上很少发生其他不利的变异[3]。随着植物组织培养技术的日趋成熟，在传统的化学诱导基础上，通过组织培养结合秋水仙素诱导诱导植物多倍体的技术手段得以发展。越来越多的植物建立了组织培养再生体系，使得秋水仙素在离体水平上诱导细胞内染色体加倍成为可能[4](谭德冠等，2005)。
Phillips和Luteyn [5]以萌发的种子为外植体,获得了体细胞胚,但是诱导率较低,只有7%。Saker [6]以成熟种子为外植体,在MS培养基上添加2 mg/L的 2,4D获得胚性愈伤组织,添加1 mg/L的 KT的培养基上培养,愈伤组织表面上产生体细胞胚并获得再生苗。姜聰琰[7]用洋葱花蕾为外植体,在 2 mg* L12，4D + 2 mg* L1 6BA + 1 mg* L1KT + 0.5 mg* L1NAA的MS培养基上,愈伤组织的最高诱导率为41.11%,培养得到了胚性愈伤组织和胚状体,获得了洋葱再生植株。
孔红等人研究非洲凤仙发现，在0.2%秋水仙素作用下，四倍体诱导率随处理时间的增加而增大，0. 5%浓度处理的诱导率均达15%，但处理72 h时死亡率高达30%。因此，在0. 5%浓度，48 h条件下诱导效果最好[8]。
黄永莲等（2005）研究表明，0.05%的秋水仙素诱导产生双核比其它浓度明显，浓度越高产生的多核细胞就越明显;而0.1%浓度则诱导产生微核细胞比较明显。秋水仙素诱发变异的最佳处理时问一般在24 48h之后，这时的染色体变异和细胞畸变频率最高[9]。张素芝和李纪蓉(2006)研究表明，25. 30℃时短时间处理的诱导率明显高于4℃低温处理，但处理时间较长时4℃低温也有较高的诱导率[10]。
相关研穷表明，以气生鳞茎为外植体的大蒜愈伤组织途径或不定芽途径的组织培养再生体系均可获得染色体加倍效果[11]（马雯等，2011）。董飞等(2011)以大葱种子为处理材料，发现0.8%的秋水仙素浸泡处理48h，组织培养变异幼苗去玻璃化，获得了正常生长的四倍体植株[12]。另外还有关于物理诱导法、有性杂交、原生质体培养、体细胞融合等洋葱细胞培养的研究报道[1319]。
多倍体植物在新开放或相对不稳定的环境中具有更强的生存能力和更大的生理生化灵活性，比二倍体祖先或近缘种更能耐受恶劣环境，在营养繁殖和多年生植物中具有明显的优势[3]。
1 材料与方法
1.1材料
（1）药品试剂。秋水仙碱、BDS培养基 、6苄氨基腺嘌呤（6BA）、萘乙酸（NAA）、二甲基亚砜（DMSO）、酒精、次氯酸钠溶液、多菌灵。
（2）试剂配制。1%的秋水仙碱母液：称1g秋水仙素碱，溶解在2%二甲基亚砜（DMSO）中，再加蒸馏水稀释至100ml。
（3）洋葱。供试材料为W470，由大学园艺站提供，实验在大学作物遗传与种质创新国家重点实验室组培室进行。
（4）基础培养基。均使用固体BDS培养基为基本培养基，添加不同的植物激素，蔗糖3%，琼脂0.75%，调pH值至5.75.8。
1.2 实验方法及步骤
（1）技术路线
洋葱材料 消毒 取其鳞茎盘 加诱导剂培养 发芽培养 生根培养 培养成苗 检测倍性
（2）实验方案：
1）前期处理
将冷藏洋葱球拨出外皮至直径为23cm，用自来水洗干净，拿至超净工作台，用75%酒精浸泡1min（摇晃），再用无菌水冲洗5次后，再次将外皮剥尽，留下鳞茎盘，用10%次氯酸钠溶液浸泡15min，无菌水冲洗5次，无菌滤纸吸干水分，在无菌条件下用消过毒的手术刀将洋葱切除至鳞茎盘为1~2cm厚、贴近鳞茎盘的鳞茎长、宽各为4~5mm、高为1.0~1.5mm做带有一个肉眼可观的芽眼外植体。
2）加秋水仙素培养
固体培养基：转入含有秋水仙素碱浓度分别为0、0.010%、0.015%、0.020%的愈伤组织诱导培养基（BDS+0.35mg/L NAA+0.9mg/L6BA）中，处理时间分别为24h、48h，共8个组合，每个组合100粒洋葱鳞茎盘。培养温度（22+/1）℃，光照强度2000lx，光照时14h/d,RH为90%。
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