重要转录因子sbpbox在葡萄果实发育成熟过程中的时空表达分析
摘要：SBP-box家族是植物特有的一个转录因子家族。研究表明，该家族基因可能参与植物果实成熟发育过程，且在葡萄中已鉴定了本家族部分成员。为揭示SBP-box家族在葡萄果实发育成熟过程的作用机理，本实验利用RT-PCR分析SBP-box在葡萄果实成熟中的时空表达图谱。结果表明，VvSBP4、VvSBP5、VvSBP6、VvSBP7、VvSBP8、VvSBP9、VvSBP15、VvSBP16、VvSBP17、VvSBP18、VvSBP19、VvSBP20等均在葡萄果实成熟过程中有一定表达，其中VvSBP15、VvSBP16、VvSBP17随果实成熟表达量逐渐升高，其余呈现出相反的表达模式，表明它们分别通过促进或抑制的方式调控葡萄果实成熟过程；进一步利用ABA、NAA处理，验证SBP-BOX家族中重要成员在葡萄果实成熟过程的作用。本研究为从转录因子角度认识葡萄果实成熟过程提供一定的参考依据，也为深入研究这些基因的功能提供理论参考。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1．1 实验材料 2
1．1．1 葡萄材料 2
1．1．2 主要仪器设备 2
1．2 实验方法 3
1．2．1 总RNA的提取 3
1．2．2 RNA的消化 3
1．2．3 葡萄cDNA合成 3
1．2．4 SBPbox基因的半定量RTPCR 4
1．2．5 引物设计 4
2 结果与分析 5
2．1 RNA提取、cDNA文库构建、稀释倍数的确定 5
2．1．1 RNA胶图分析 5
2．1．2 RNA的OD值分析 5
2．1．3 cDNA文库构建数据记录 5
2．1．4 cDNA文库稀释倍数记录 6
2．2 SBPBOX在葡萄果实成熟过程中时空表达及分析 6
2．2．1 葡萄果实发育不同阶段SBP基因的表达分析 8
2．2．2 NAA、ABA处理果实后SBP基因的表
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
达分析 8
3 讨论 8
致谢 9
参考文献 10
重要转录因子SBPbox在葡萄果实发育成熟过程中的时空表达分析
引言
转录因子（TF），是与 DNA序列直接或间接结合并参与靶基因转录过程的调控因子[、]。SBPbox 是植物所特有的一类转录因子，广泛存在于绿色植物中(从单细胞的衣藻(属)Chlamydomonas 到高等植物)。目前，大量的研究表明SBPbox转录因子在植物生长发育的多个方面起着重要作用[]。SBPbox最早是从金鱼草花序cDNA文库中筛选到的，因其能够识别并结合到SQUAMOSA（SQUA）的启动子上而得名[]。SPL是类似SBPbox的一类转录因子的总称。据报道，SPL转录因子在植物花的形成及后期发育，植物的育性，营养生长向生殖生长的转型，叶的形态建成，环境信号应答等方面均发挥重要作用[、、]。拟南芥中过量表达AtSPL9和AtSPL10均可延长间隔期，降低叶片的生成率，最终导致叶面数量的减少[5]；过量表达拟南芥AtSPL3不仅会促进开花，而且在长日照和连续光照条件下还会导致花和花序发育异常。拟南芥AtSPL10可以影响花柄发育，抑制AtSPL10会缩短花柄长度[6]。Wang等的研究表明SPL可通过MADSbox基因来调控植物开花时间；拟南芥AtSPL8基因功能缺失会导致花药小、花粉少、果短小、育性低；SPL可通过抑制DFR基因的转录活性来调控花青素的合成[]；拟南芥SBPlike 10(SPL10)基因能够影响果荚的长度；水稻SPL16可以调控控米粒大小、形状和色泽[、]。这些研究表明，SPB家族参与植物生长发育的不同方面的调控。
尽管在许多植物种类（如拟南芥、水稻和杨树）中已鉴定出了大量的SBPbox基因，但不同物种间它们家族的成员数量与功能存在重要差异，而且这些鉴定的转录因子主要集中在花器官形成与开花时间的发育调控方面。相比之下，葡萄方面相关研究颇少，有关SBPbox调控葡萄果实成熟的研究更无报道。另一方面，与拟南芥、水稻相比，葡萄是肉质果实，与果实研究较为充分的苹果和番茄相比[]，葡萄属于非呼吸跃变型[]。因此，在葡萄上开展SBPbox转录因子调控果实发育与成熟的研究很有必要。目前，葡萄方面仅有几篇关于SBPBOX家族预测及该家族个别成员表达分析的研究[、]。本研究室前期曾对SBPbox家族开展了初步研究，克隆了葡萄SBPbox家族的两个成员（VvSPL9、VvSPL10），并利用定量RTPCR分析其在葡萄不同组织中的表达，发现它们在不同组织中呈现明显的时空特异性表达，且在果实发育过程中表达量呈现降低趋势[、]，表明它们与葡萄果实发育有关。为进一步认识SBPbox家族不同成员对葡萄果实成熟过程的调控作用，本文利用RTPCR技术分析了SBPbox家族不同成员在葡萄果实成熟过程的时空表达特性，并通过ABA和NAA处理验证参与葡萄果实成熟过程中SBPbox家族的重要成员，初步阐释SBPbox家族在葡萄果实成熟发育过程的调控作用。本研究将有助于从分子水平认识葡萄果实成熟过程，并为有效利用重要基因调控葡萄果实成熟过程提供一定的理论依据。
1 材料与方法
1．1 实验材料
1．1．1 葡萄材料
基于前期研究基础及开展相关研究工作的需要，本研究拟以江苏省农科院葡萄实验基地的五年生的优质、高产的欧美杂种四倍体‘巨玫瑰’葡萄为研究试材。依据生产经验结合品种特性，选择葡萄果实发育的七个典型时期（幼果期、幼果膨大期、硬核期、第二次膨大期、转色期、转色后15天、成熟期），随机从9株葡萄27个果穗上采集果实样品用于构建转录组文库。
试验材料作如下处理：ABA处理（参照王延书，2011）[]：在转色前1周，选择6穗长势相对一致的果穗，其中3穗用600mg/kg ABA涂抹，另3穗以清水处理作为对照；NAA处理（参照周莉，2011）[]：在转色前1周，与ABA处理相似，也选择6穗果实，其中3穗用200mg/kg NNA涂抹处理，另3穗用清水处理作为对照；对上述两种处理及相应的对照分别在转色期、转色后15天、成熟期动态采集果实样品。
样品采集保证每次从不同果穗的多个不同部位采取，以保证样品的代表性，采集后样品放入液氮速冻，带回实验室70℃保存备用。最终采集到13个样品，对应于七个典型发育时期和分别用ABA、NAA处理的果实，编号为1、2、3、4、5、6、7、N5、A5、N6、A6、N7、A7。
1．1．2 主要仪器设备
冷冻离心机；超净工作台； PCR 仪；紫外凝胶成像系统；常温离心机；涡旋机；水浴锅；70℃、40℃、20℃、4℃冰箱。
1．2 实验方法
1．2．1 总RNA的提取
本研究使用实验室改进的总RNA提取方法，提取不同发育时期葡萄果实以及不同处理与对照果实的总RNA（参照张彦平，2010）[]。
样品研磨后加65℃预热的山梨醇800ul，β巯基乙醇50ul，静置5min，8000r/min，5min后取沉淀加入SDS1100ul，β巯基乙醇55ul。
在水浴锅中放置3045分钟，每间隔10min颠倒混匀。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1．1 实验材料 2
1．1．1 葡萄材料 2
1．1．2 主要仪器设备 2
1．2 实验方法 3
1．2．1 总RNA的提取 3
1．2．2 RNA的消化 3
1．2．3 葡萄cDNA合成 3
1．2．4 SBPbox基因的半定量RTPCR 4
1．2．5 引物设计 4
2 结果与分析 5
2．1 RNA提取、cDNA文库构建、稀释倍数的确定 5
2．1．1 RNA胶图分析 5
2．1．2 RNA的OD值分析 5
2．1．3 cDNA文库构建数据记录 5
2．1．4 cDNA文库稀释倍数记录 6
2．2 SBPBOX在葡萄果实成熟过程中时空表达及分析 6
2．2．1 葡萄果实发育不同阶段SBP基因的表达分析 8
2．2．2 NAA、ABA处理果实后SBP基因的表
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
达分析 8
3 讨论 8
致谢 9
参考文献 10
重要转录因子SBPbox在葡萄果实发育成熟过程中的时空表达分析
引言
转录因子（TF），是与 DNA序列直接或间接结合并参与靶基因转录过程的调控因子[、]。SBPbox 是植物所特有的一类转录因子，广泛存在于绿色植物中(从单细胞的衣藻(属)Chlamydomonas 到高等植物)。目前，大量的研究表明SBPbox转录因子在植物生长发育的多个方面起着重要作用[]。SBPbox最早是从金鱼草花序cDNA文库中筛选到的，因其能够识别并结合到SQUAMOSA（SQUA）的启动子上而得名[]。SPL是类似SBPbox的一类转录因子的总称。据报道，SPL转录因子在植物花的形成及后期发育，植物的育性，营养生长向生殖生长的转型，叶的形态建成，环境信号应答等方面均发挥重要作用[、、]。拟南芥中过量表达AtSPL9和AtSPL10均可延长间隔期，降低叶片的生成率，最终导致叶面数量的减少[5]；过量表达拟南芥AtSPL3不仅会促进开花，而且在长日照和连续光照条件下还会导致花和花序发育异常。拟南芥AtSPL10可以影响花柄发育，抑制AtSPL10会缩短花柄长度[6]。Wang等的研究表明SPL可通过MADSbox基因来调控植物开花时间；拟南芥AtSPL8基因功能缺失会导致花药小、花粉少、果短小、育性低；SPL可通过抑制DFR基因的转录活性来调控花青素的合成[]；拟南芥SBPlike 10(SPL10)基因能够影响果荚的长度；水稻SPL16可以调控控米粒大小、形状和色泽[、]。这些研究表明，SPB家族参与植物生长发育的不同方面的调控。
尽管在许多植物种类（如拟南芥、水稻和杨树）中已鉴定出了大量的SBPbox基因，但不同物种间它们家族的成员数量与功能存在重要差异，而且这些鉴定的转录因子主要集中在花器官形成与开花时间的发育调控方面。相比之下，葡萄方面相关研究颇少，有关SBPbox调控葡萄果实成熟的研究更无报道。另一方面，与拟南芥、水稻相比，葡萄是肉质果实，与果实研究较为充分的苹果和番茄相比[]，葡萄属于非呼吸跃变型[]。因此，在葡萄上开展SBPbox转录因子调控果实发育与成熟的研究很有必要。目前，葡萄方面仅有几篇关于SBPBOX家族预测及该家族个别成员表达分析的研究[、]。本研究室前期曾对SBPbox家族开展了初步研究，克隆了葡萄SBPbox家族的两个成员（VvSPL9、VvSPL10），并利用定量RTPCR分析其在葡萄不同组织中的表达，发现它们在不同组织中呈现明显的时空特异性表达，且在果实发育过程中表达量呈现降低趋势[、]，表明它们与葡萄果实发育有关。为进一步认识SBPbox家族不同成员对葡萄果实成熟过程的调控作用，本文利用RTPCR技术分析了SBPbox家族不同成员在葡萄果实成熟过程的时空表达特性，并通过ABA和NAA处理验证参与葡萄果实成熟过程中SBPbox家族的重要成员，初步阐释SBPbox家族在葡萄果实成熟发育过程的调控作用。本研究将有助于从分子水平认识葡萄果实成熟过程，并为有效利用重要基因调控葡萄果实成熟过程提供一定的理论依据。
1 材料与方法
1．1 实验材料
1．1．1 葡萄材料
基于前期研究基础及开展相关研究工作的需要，本研究拟以江苏省农科院葡萄实验基地的五年生的优质、高产的欧美杂种四倍体‘巨玫瑰’葡萄为研究试材。依据生产经验结合品种特性，选择葡萄果实发育的七个典型时期（幼果期、幼果膨大期、硬核期、第二次膨大期、转色期、转色后15天、成熟期），随机从9株葡萄27个果穗上采集果实样品用于构建转录组文库。
试验材料作如下处理：ABA处理（参照王延书，2011）[]：在转色前1周，选择6穗长势相对一致的果穗，其中3穗用600mg/kg ABA涂抹，另3穗以清水处理作为对照；NAA处理（参照周莉，2011）[]：在转色前1周，与ABA处理相似，也选择6穗果实，其中3穗用200mg/kg NNA涂抹处理，另3穗用清水处理作为对照；对上述两种处理及相应的对照分别在转色期、转色后15天、成熟期动态采集果实样品。
样品采集保证每次从不同果穗的多个不同部位采取，以保证样品的代表性，采集后样品放入液氮速冻，带回实验室70℃保存备用。最终采集到13个样品，对应于七个典型发育时期和分别用ABA、NAA处理的果实，编号为1、2、3、4、5、6、7、N5、A5、N6、A6、N7、A7。
1．1．2 主要仪器设备
冷冻离心机；超净工作台； PCR 仪；紫外凝胶成像系统；常温离心机；涡旋机；水浴锅；70℃、40℃、20℃、4℃冰箱。
1．2 实验方法
1．2．1 总RNA的提取
本研究使用实验室改进的总RNA提取方法，提取不同发育时期葡萄果实以及不同处理与对照果实的总RNA（参照张彦平，2010）[]。
样品研磨后加65℃预热的山梨醇800ul，β巯基乙醇50ul，静置5min，8000r/min，5min后取沉淀加入SDS1100ul，β巯基乙醇55ul。
在水浴锅中放置3045分钟，每间隔10min颠倒混匀。
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