nadph氧化酶介导硒抑制不结球白菜根伸长的研究
摘要：为了研究NADPH氧化酶是否参与硒迫下活性氧的生成，本实验以不结球白菜为材料，探究NADPH氧化酶介导硒抑制不结球白菜根系伸长的生理机制。实验发现，硒能诱导根尖ROS的快速累积；外源添加NADPH氧化酶抑制剂后，ROS含量显著下降，幼苗根长受抑制程度降低；进一步通过BLAST搜索，筛选出响应硒胁迫的Rboh基因，并用实时荧光定量的方法检测幼苗根中Br_Rbohs基因的表达情况，结果表明硒通过诱导Br_Rbohs基因表达，增加NADPH氧化酶含量，进而使ROS过量积累。
目录
摘要 2
关键词 3
Abstract. 3
Key words 3
引言 3
1 材料与方法 3
1.1 实验材料 4
1.2 实验设计 4
1.3 指标测定 4
1.3.1 测量根长 4
1.3.2 根尖ROS检测 4
1.3.3 白菜基因组筛选和分析Br_Rbohs基因 4
1.3.4 Br_Rbohs基因转录分析 4
2 结果与分析 5
2.1 Na2SeO3处理对不结球白菜根系生长的影响 5
2.2 不同浓度Na2SeO3对小白菜根尖内源ROS含量影响 6
2.3 Na2SeO3胁迫下不结球白菜根内ROS与根长的相关性研究 6
2.4 NADPH氧化酶抑制剂对不结球白菜根长的影响 7
2.5 NADPH氧化酶抑制剂对不结球白菜根内ROS含量的影响 7
2.6 不结球白菜中Br_RbohS基因多重比对分析 8
2.7 不同硒处理时间条件下，Br_RbohS基因表达变化情况 10
3 讨论 11
致谢 11
参考文献： 11
NADPH氧化酶介导的硒抑制不结球白菜根伸长的研究
园艺 雷香
引言
引言
1932年，在植物中检测出了硒[1]，1957年，确证硒为高等动物必需的微量元素[2]。硒与人体的免疫功能、抗氧化及抗癌作用密切相关,缺硒是
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
诱发克山病、大骨病等的主要因素[3]。研究表明，硒可能是高等植物生长所必需的营养元素[4]。植物硒具有较高的生物利用度和生物活性，并且在硒生态链中起着不可或缺的作用[5]。目前，国内外围绕硒对植物生理功能的影响做了大量的研究工作，涉及硒对种子萌发、根系活力、生长、酶活性、叶绿素含量、营养元素吸收和植物品质[6]。极少量的硒能刺激硒积聚植物的生长、强烈地抑制硒非积聚物质的生长。在较高浓度下，大部分植物出现硒毒害症状，生长及生理活动受到抑制[7]。然而过量的硒与有效硒用量之间的幅度很小，稍有不慎就可能发生硒中毒现象，部分地区土壤硒含量过高对植物生长产生抑制作用。在农业生产中为获得富硒产品，大量硒肥的使用，导致农作物受到一定的抑制[8]。这就使在富硒过程中存在着很大的技术难题。目前为防止硒对植物胁迫的具体机制还相当有限，因此，在理论上，了解硒影响植物生长的具体机理，硒对作物生长发育进程的影响是十分必要的。
植物NADPH氧化酶又被称为呼吸爆发氧化酶（Rbohs）[9]，是植物细胞ROS产生的主要酶[10]。目前已经在多种植物体内分离出来，并检测到了其转录产物[11]。当植物受到生物或非生物胁迫时,NADPH氧化酶短时间内通过自身的激活或失活迅速引起活性氧ROS的升高或降低,来调节基因表达和细胞代谢,使植物及时对逆境胁迫作出反应,以适应环境的变化[12]。可见，NADPH氧化酶在生物和非生物胁迫中起着十分重要的作用。随着分子生物学及各种实验技术的发展，对该酶的研究也逐步深入；但在某些方面尚未能完全阐明，如其酶活性的具体调控机制及与其他信号分子间的交互作用等，都还需要做进一步的深入研究。
目前，关于研究硒对植物胁迫的机理也还十分有限，只有深入了解硒在植物体内的调控机制，才能满足富硒生产的需要。本实验结合实际生产生活中硒对植物生长的毒害现象，研究较高浓度的硒对植物生长的抑制作用，探讨NADPH氧化酶在硒毒害植物过程中的作用，最终发现高浓度硒对植物毒害作用机理，为解决现实生产中植物富硒障碍奠定理论基础。
1 材料与方法
1.1 实验材料
供试材料：不结球白菜‘五月慢’，购自南京绿领种业有限公司。
供试试剂：Na2SeO3，二联苯碘（diphenylene iodonium，DPI），吡啶（pyridine，PY），咪唑（imidazole，IMZ），钨酸钠（sodium tungstate，Tungstate，Na2WO4），特异性荧光DCFHDA（2,7二氯荧光黄双乙酸盐），Trizol，Oligo（dT），dNTPs，RNase抑制剂，MMLV，蒸馏水。
主要实验仪器：智能光照培养箱（江南仪器厂）；荧光显微镜（ECLIPSE，TE2000S，日本Nikon公司）；普通PCR仪（T100，美国BIORad公司）；实时定量荧光PCR仪（ABI7500）；凝胶成像系统（Gel Doc 2000，上海天能科技有限公司）等。
1.2 实验设计
种子用1%的NaClO消毒10分钟，用单蒸水冲洗3次，然后将种子撒播在消毒的蛭石上，每12 h浇灌一次自来水，待幼苗根长约为1 cm左右时开始处理。设置6个处理：CK(1/2 Hoagland)[13]、Na2SeO3浓度分别为0.03，0.06，0.12，0.23，0.46 mM，各处理组分别处理0，6，12，24，48，72 h后取样，检测Br_Rbohs表达情况。在Na2SeO3（0.06 mmol/L）胁迫的基础上，添加NADPH氧化酶抑制剂DPI（10 μmol/L）、PY（5 mmol/L）、IMZ（0.5 mmol/L），分析NADPH氧化酶在硒胁迫中的作用。
1.3 指标测定
1.3.1 测量根长
将不同处理下的不结球白菜幼苗取出清洗干净，测量其根系长度。
1.3.2 根尖ROS检测
采用Foreman[14]描述的DCFHDA荧光探针检测。将处理后的幼苗根在1 μmol/L的DCFHDA中25°C处理20 min，再去离子水清洗3次后在荧光显微镜下（激发光波长488 nm，发射光525 nm）进行成像（ECLIPSE，TE2000S，Nikon）。
目录
摘要 2
关键词 3
Abstract. 3
Key words 3
引言 3
1 材料与方法 3
1.1 实验材料 4
1.2 实验设计 4
1.3 指标测定 4
1.3.1 测量根长 4
1.3.2 根尖ROS检测 4
1.3.3 白菜基因组筛选和分析Br_Rbohs基因 4
1.3.4 Br_Rbohs基因转录分析 4
2 结果与分析 5
2.1 Na2SeO3处理对不结球白菜根系生长的影响 5
2.2 不同浓度Na2SeO3对小白菜根尖内源ROS含量影响 6
2.3 Na2SeO3胁迫下不结球白菜根内ROS与根长的相关性研究 6
2.4 NADPH氧化酶抑制剂对不结球白菜根长的影响 7
2.5 NADPH氧化酶抑制剂对不结球白菜根内ROS含量的影响 7
2.6 不结球白菜中Br_RbohS基因多重比对分析 8
2.7 不同硒处理时间条件下，Br_RbohS基因表达变化情况 10
3 讨论 11
致谢 11
参考文献： 11
NADPH氧化酶介导的硒抑制不结球白菜根伸长的研究
园艺 雷香
引言
引言
1932年，在植物中检测出了硒[1]，1957年，确证硒为高等动物必需的微量元素[2]。硒与人体的免疫功能、抗氧化及抗癌作用密切相关,缺硒是
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
诱发克山病、大骨病等的主要因素[3]。研究表明，硒可能是高等植物生长所必需的营养元素[4]。植物硒具有较高的生物利用度和生物活性，并且在硒生态链中起着不可或缺的作用[5]。目前，国内外围绕硒对植物生理功能的影响做了大量的研究工作，涉及硒对种子萌发、根系活力、生长、酶活性、叶绿素含量、营养元素吸收和植物品质[6]。极少量的硒能刺激硒积聚植物的生长、强烈地抑制硒非积聚物质的生长。在较高浓度下，大部分植物出现硒毒害症状，生长及生理活动受到抑制[7]。然而过量的硒与有效硒用量之间的幅度很小，稍有不慎就可能发生硒中毒现象，部分地区土壤硒含量过高对植物生长产生抑制作用。在农业生产中为获得富硒产品，大量硒肥的使用，导致农作物受到一定的抑制[8]。这就使在富硒过程中存在着很大的技术难题。目前为防止硒对植物胁迫的具体机制还相当有限，因此，在理论上，了解硒影响植物生长的具体机理，硒对作物生长发育进程的影响是十分必要的。
植物NADPH氧化酶又被称为呼吸爆发氧化酶（Rbohs）[9]，是植物细胞ROS产生的主要酶[10]。目前已经在多种植物体内分离出来，并检测到了其转录产物[11]。当植物受到生物或非生物胁迫时,NADPH氧化酶短时间内通过自身的激活或失活迅速引起活性氧ROS的升高或降低,来调节基因表达和细胞代谢,使植物及时对逆境胁迫作出反应,以适应环境的变化[12]。可见，NADPH氧化酶在生物和非生物胁迫中起着十分重要的作用。随着分子生物学及各种实验技术的发展，对该酶的研究也逐步深入；但在某些方面尚未能完全阐明，如其酶活性的具体调控机制及与其他信号分子间的交互作用等，都还需要做进一步的深入研究。
目前，关于研究硒对植物胁迫的机理也还十分有限，只有深入了解硒在植物体内的调控机制，才能满足富硒生产的需要。本实验结合实际生产生活中硒对植物生长的毒害现象，研究较高浓度的硒对植物生长的抑制作用，探讨NADPH氧化酶在硒毒害植物过程中的作用，最终发现高浓度硒对植物毒害作用机理，为解决现实生产中植物富硒障碍奠定理论基础。
1 材料与方法
1.1 实验材料
供试材料：不结球白菜‘五月慢’，购自南京绿领种业有限公司。
供试试剂：Na2SeO3，二联苯碘（diphenylene iodonium，DPI），吡啶（pyridine，PY），咪唑（imidazole，IMZ），钨酸钠（sodium tungstate，Tungstate，Na2WO4），特异性荧光DCFHDA（2,7二氯荧光黄双乙酸盐），Trizol，Oligo（dT），dNTPs，RNase抑制剂，MMLV，蒸馏水。
主要实验仪器：智能光照培养箱（江南仪器厂）；荧光显微镜（ECLIPSE，TE2000S，日本Nikon公司）；普通PCR仪（T100，美国BIORad公司）；实时定量荧光PCR仪（ABI7500）；凝胶成像系统（Gel Doc 2000，上海天能科技有限公司）等。
1.2 实验设计
种子用1%的NaClO消毒10分钟，用单蒸水冲洗3次，然后将种子撒播在消毒的蛭石上，每12 h浇灌一次自来水，待幼苗根长约为1 cm左右时开始处理。设置6个处理：CK(1/2 Hoagland)[13]、Na2SeO3浓度分别为0.03，0.06，0.12，0.23，0.46 mM，各处理组分别处理0，6，12，24，48，72 h后取样，检测Br_Rbohs表达情况。在Na2SeO3（0.06 mmol/L）胁迫的基础上，添加NADPH氧化酶抑制剂DPI（10 μmol/L）、PY（5 mmol/L）、IMZ（0.5 mmol/L），分析NADPH氧化酶在硒胁迫中的作用。
1.3 指标测定
1.3.1 测量根长
将不同处理下的不结球白菜幼苗取出清洗干净，测量其根系长度。
1.3.2 根尖ROS检测
采用Foreman[14]描述的DCFHDA荧光探针检测。将处理后的幼苗根在1 μmol/L的DCFHDA中25°C处理20 min，再去离子水清洗3次后在荧光显微镜下（激发光波长488 nm，发射光525 nm）进行成像（ECLIPSE，TE2000S，Nikon）。
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