翦股颖草坪草在高温和干旱胁迫下抗氧化代谢的变化
以冷季型草坪草匍匐翦股颖(Agrostis stolonifera L.)L-93为试验材料，在高温、干旱以及高温干旱双重逆境胁迫下研究植株叶片相对含水量、膜透性、丙二醛含量以及抗氧化酶活性的趋势。结果表明，在不同胁迫处理下，叶片相对含水量降低；膜透性增大；MDA含量增多；SOD活性均出现先上升后下降的趋势；POD和CAT活性随处理的延长会不断降低。高温和干旱双重胁迫对植物的伤害最为严重，叶片相对含水量和抗氧化物酶活性急速降低，短时间内植物体内MDA含量大量快幅度升高。在单一胁迫处理中，干旱造成叶片相对含水量和抗氧化酶活性的下降更为明显，同时膜透性和MDA含量发生变化的时间更短。关键字匍匐翦股颖；抗氧化代谢；双重逆境；高温；干旱Antioxidant metabolic changes of Agrostis stolonifera under the stress of?heat and droughtStudent majoring in horticulture DuanKaiTutor YangZhiMinAbstract: The experiment was designed to analyse relative water content, electrolyte leakage , Malondialdehyde (MDA) and antioxidant enzymes in drought, heat and combined stresses with cool-season turfgrasses Agrostis stolonifera L-93 as test material. The results showed that under different stress treatments, leaf relative water content decreased; electrolyte leakage and MDA increased; Superoxide dismutase (SOD) activity was decreased after the first rising trend; Peroxidase (POD) and Catalase (CAT) activity will continue to de *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
crease with prolonged treatment. Combined stresses most serious damage to the plant,?leaf relative water content and antioxidant enzyme activity rapidly decreased, MDA have a large increase in a short period of time. In the?single stress,?drought caused relative water content and enzymes for antioxidant decreased more obvious, and electrolyte leakage and MDA changed earlier.匍匐翦股颖(Agrostis stolonifera L.)为禾本科翦股颖属多年生草本植物，俗名本特草、四季青，是一种冷季型草坪草。翦股颖具有绿期长、矮生、叶细、株密的优异特性，质量超过其他任何冷季型草坪草，且质地细软、恢复能力强，耐频繁低剪，成为最具应用潜力的种质资源之一 ，因此在我国园林绿化中有着广泛的应用[1]。在我国气候过渡地区，夏季高温，并伴随降水的减少，使高温和干旱双重胁迫成为制约草坪草生长的主要因素[2]。逆境胁迫对草坪草造成的伤害主要体现在草坪景观质量下降；叶片相对含水量下降，出现叶片萎蔫甚至干枯；叶绿素分解速度加快，叶色逐步呈现枯黄；叶片细胞膜稳定性遭到破坏；叶片中短时间内出现大量丙二醛积累等，而生理结构上的损伤多由于植株体内氧化物质积累造成[3]。在多重胁迫环境下，高温胁迫加剧干旱胁迫，植物失水速度提高，叶片枯黄面积增大，草坪质量迅速降低，植株短时间内会出现大面积死亡[4]。植物在逆境胁迫时体内活性氧增加，导致脂质过氧化，使细胞膜系统受到伤害，从而严重影响生物膜的功能[5]。当活性氧的累积超过一定域值时，促使膜脂中不饱和脂肪酸过氧化产生丙二醛( MDA ), MDA能与酶蛋白发生链式反应聚合，使膜系统变性。因此，MDA可作为活性氧造成膜脂过氧化的主要产物之一，可作为衡量脂质过氧化程度的指标，其含量的多少与植物的抗逆性有着紧密的关系[6]。而堪称植物膜保护的三大酶系，即超氧化物歧化酶( SOD )、过氧化物酶( POD)和过氧化氢酶( CAT)，都具有清除活性氧自由基的作用，提高植物对不利环境的适应能力 [7]。目前已有一些关于高温干旱双重胁迫的报道，高温与干旱多是同时存在的[8]。万里强等选取多年生黑麦草作为试验材料，观察了叶绿体和线粒体超微结构的变化，结果显示，耐热抗旱性较强的品种叶绿体受损程度较轻[9]。刘晓军等以苇状羊茅为材料，研究了干热胁迫下，苇状羊茅对不同水肥条件的响应机理[10]。而有关双重胁迫对草坪草抗氧化系统影响的研究研究报道较少。草坪草生长在多变的环境中，往往会同时或相继遭受不同逆境的影响，在长期适应中形成对不同逆境双重适应的特性。本研究利用人工气候箱模拟干旱与高温环境，观察和比较了在不同胁迫下，冷季型草坪草匍匐翦股颖抗氧化代谢的变化规律，揭示冷季型草坪草应对温度升高和水分亏缺的生化机理，为培育抗热抗旱型草坪草新品种提供理论依据。1.材料与方法1.1材料试验在大学牌楼实验教学基地的温室内进行。试验材料选取常见冷季型草坪草匍匐翦股颖L-93。材料培养初期，采用5 g/㎡的种植密度将种子播撒在容器中；种子萌发3个月后移入温室内进行扩繁生长。9个月过后，选取生长状况一致，长势良好的植株作为试验材料，移入高20cm，直径15cm的塑料盆中进行实验。栽培基质为草炭沙 = 2:1。材料培养期间，每周施用一次1/2倍的Hogland营养液。试验处理试验采取随机区组设计，处理分为对照处理、高温处理、干旱处理以及高温干旱双重胁迫处理。每个处理设置四盆重复，每盆移入20棵L-93植株。材料提前一星期放入人工气候箱内进行适应性生长，箱内控制湿度50%，光照12000 lux。具体处理方法对照处理，昼温25 ℃/夜温15 ℃，光周期12 h/12 h，每三天补水一次，每个塑料盆补水500 ml。高温处理，昼温35 ℃/夜温25 ℃，光周期12 h/12 h。每三天补水一次，每个塑料盆补水500 ml。干旱处理，昼温25 ℃/夜温15 ℃，光周期12 h/12 h。自然干旱，不进行任何形式的补水。双重逆境处理，昼温35 ℃/夜温25℃，光周期12 h/12 h。试验期间不进行任何形式的补水。测定指标及方法试验样品的采集与指标的测定每3天进行一次，整个过程共进行4次重复。1.3.1 叶片相对含水量剪取新鲜叶片0.2 g，wf；将取得的叶片组织浸泡于去离子水中24 h，取出用吸水纸擦干表面水分，称取其饱和重wt；随后将叶片转移至80 ℃烘箱内烘24 h，冷却至室温后称取其干重，wd。相对含水量=（wf﹣wd）/（wt﹣wd）*100%1.3.2 叶片膜透性采取相对电导率法[11]，将叶片浸泡于装有去离子水的50 ml离心管中，震荡24小时后测定电导率率值，E0；随后将离心管放入水浴中，煮沸后测定电导率值，Eb。相对电导率= E0/Eb*100%1.3.3 丙二醛（MDA）丙二醛（MDA）含量测定，采用李合生的巴比妥酸（TBA）显色法测定[12]。取0.5 g叶片，加入5% TCA 5 ml，研磨后所得匀浆在3000 r/min下离心10 min。取上清液2 ml，加入0.67% TBA 2 ml，混合后在100℃水浴上煮沸30 min，冷却后再离心一次。分别测定上清液在450 nm、532 nm、和600 nm处的吸光值A。丙二醛浓度C(μmol/L)=6.45(A532﹣A600)﹣0.56 A4501.3.4抗氧化物酶取叶片0.5 g，加入液氮研磨成粉末状后溶解于4 ml磷酸缓冲液（pH 7.8,0.05 mol/L），在4℃、12000 r/min下离心20 min，得到的上清液放入4℃条件下保存，用于测定超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）的活性。SOD活性采取氮蓝四唑（NBT）还原法测定[11]取50μL酶液，加入混合反应液，含0.05 mol/L磷酸缓冲液、0.13 mol/L Met溶液、750 μmol/L NBT溶液、100 μmol/L EDTA-Na2溶液、20μmol/L核黄素溶液，以不加酶液作为对照，测量560 nm处的吸光值。POD活性测定通过愈创木酚法测定[11-12]取40μL酶液，加入反应液含50 ml 0.2mol/L pH 6.0的磷酸缓冲液、28μL愈创木酚、19μL 30% H2O2溶液，以磷酸缓冲液作对照，测量470nm处的吸光值。CAT活性的测定[11-12]取0.1 mL酶液，加入2.9 mL反应液，以磷酸缓冲液作对照，测定1 min内240 nm处吸光值的变化。反应液中含有100 mL 0.05 mol/L pH 7.0的磷酸缓冲液、0.1546 ml 30% H2O2溶液。试验测定使用的紫外分光光度计为美国通用GE Ultrospec 9000型。试验数据处理采用SPSS13.0进行数据处理与分析，LSD法检验差异显著性（P <0.05）。2.结果与分析2.1 叶片相对含水量变化图1. 不同胁迫对叶片相对含水量的影响（LN:对照组；LND:干旱处理；LH:高温处理；LHD:高温干旱处理）Fig.1 Relative water content as affected by drought (LND), heat (LH) and combined stresses (LHD) in leaves of creeping bentgrass如图1所示，高温干旱双重胁迫处理后叶片相对含水量迅速下降，处理3 d就下降至24%；干旱处理3 d的后叶片含水量下降，但与对照处理及高温处理并无显著差异，处理6 d后，叶片含水量大幅下降至36%，并随处理时间增加而维持不变；高温处理6 d后叶片含水量与对照处理仍无显著差异，但9 d后出现明显下降趋势，叶片相对含水量下降到57%。胁迫处理结束后叶片相对含水量由高到低依次是对照组、高温处理、干旱处理、双重胁迫处理。2.2叶片膜透性变化图2. 不同胁迫对叶片相对电导率的影响（LN:对照组；LND:干旱处理；LH:高温处理；LHD:高温干旱处理）Fig.2 Electrolyte leakage as affected by drought (LND), heat (LH) and combined stresses (LHD) in leaves of creepingbentgrass从图2可以看出，高温干旱双重胁迫下叶片电导率增加速度明显高于其他处理，并在处理6 d后趋于稳定；高温处理6 d后叶片相对电导率并无显著变化，但9 d后电导率急速增大。干旱处理3 d到6 d期间，叶片相对电导率从37%显著增加至83%。试验结果表明，高温干旱处理与干旱处理对膜透性的影响无显著差异，高温处理造成的影响明显小于前两者。2.3叶片丙二醛含量变化图3. 不同胁迫对丙二醛（MDA）含量的影响（LN:对照组；LND:干旱处理；LH:高温处理；LHD:高温干旱处理）Fig.3 MDA as affected by drought (LND), heat (LH) and combined stresses (LHD) in leaves of creeping bentgrass如图3所示，遭受各种逆境胁迫时，植株体内MDA的含量均上升。在高温干旱胁迫下，叶片中MDA含量在处理开始后即呈现持续快速上升的趋势；干旱处理第3 d叶片才开始出现明显的丙二醛累积，与高温干旱处理相比上升幅度较小；高温处理第6 d丙二醛含量才显著增加。处理9 d后，叶片中丙二醛含量由高到低依次为高温干旱处理、干旱处理、高温处理、对照处理，其中高温处理和干旱处理之间没有显著差异。2.4 叶片抗氧化酶含量变化2.4.1 超氧化物歧化酶（SOD）图4. 不同胁迫超氧化物歧化酶（SOD）活性的影响（LN:对照组；LND:干旱处理；LH:高温处理；LHD:高温干旱处理）Fig.4 SOD activity in creeping bentgrass in response to drought (LND), heat (LH) and combined stresses (LHD) in creeping bentgrass如图4所示，各胁迫处理第3 d，SOD酶活性均显著增加，高温干旱处理下SOD酶活性显著高于其他三个处理。处理第6 d，各胁迫处理的SOD酶活性显著降低，并均低于对照水平；处理9 d后，干旱处理下SOD酶活性增加。叶片中SOD酶的活性依次为对照处理、干旱处理、高温干旱处理、高温处理。2.4.2 过氧化物酶（POD）图5.不同胁迫对过氧化物酶（POD）活性的影响（LN:对照组；LND:干旱处理；LH:高温处理；LHD:高温干旱处理）Fig.5 POD activity in creeping bentgrass in response to drought (LND), heat (LH) and combined stresses (LHD) in creeping bentgrass由图5可以看出，各种胁迫处理后POD活性均随处理时间的增加呈现大幅度降低趋势。降低的幅度，高温干旱处理远大于高温处理和干旱处理。处理9 d后，高温胁迫和干旱胁迫处理的POD活性远低于对照处理水平，远高于高温干旱胁迫处理，但两者之间差异并不显著。2.4.3 过氧化氢酶（CAT）图6.不同胁迫对过氧化氢酶（CAT）活性的影响（LN:对照组；LND:干旱处理；LH:高温处理；LHD:高温干旱处理）Fig.6 CAT activity in creeping bentgrass in response to drought (LND), heat (LH) and combined stresses (LHD) in creeping bentgrass由图6可以看出，胁迫降低CAT活性。双重胁迫处理的活性下降程度最为明显。9 d后叶片中CAT的活性由高到低依次为对照处理、高温处理、干旱处理、高温干旱处理。 3.讨论叶片相对含水量常用于衡量植物在逆境中的生长状况，叶片组织内水分状况的稳定有利于维持植物体内正常生理生化反应的运行[13]。高温胁迫发生时,对植物构成水分胁迫,使植物出现脱水现象，从而对植物的膜系统产生次生胁迫[14]。原生质膜是细胞内外的一层屏障,可以有效地防御逆境引起的伤害, 从而维持细胞结构的稳定性。当植物处于干旱胁迫时,原生质膜对干旱最为敏感，首先感受到外界环境条件的变化。 原生质膜的组成和结构发生明显变化，导致细胞内含物质大量外渗, 电导率增大。 胁迫程度越大,原生质膜受损害越大。干旱胁迫处理的L-93在处理第三天叶片相对含水量显著下降。高温处理下的L-93能较长时间保证叶片相对含水量的稳定，延缓了胁迫对其他生理结构造成伤害，这也充分说明了水分的缺失是造成植物胁迫最直接的因素。高温干旱双重胁迫处理时，一方面由于水分无法得到及时补充造成细胞脱水，另一方面高温加强了植物的蒸腾作用，结果导致L-93叶片相对含水量下降的时间点大幅提前[15]。丙二醛（MDA）作为活性氧造成膜脂过氧化的主要产物之一，可作为衡量脂质过氧化程度的指标，其含量的多少与植物的抗逆性有着紧密的关系 [16]。大量的MDA积累会造成膜系统损伤甚至变性，加深逆境对植株造成的伤害[17]。叶片相对含水量的降低以及抗氧化酶活性的下降都会导致MDA含量的上升[17]。高温干旱双重胁迫使叶片内MDA含量短时间内迅速增加，叶片电导率增加，细胞膜透性受到严重影响。MDA含量过高会影响线粒体，叶绿体等其他细胞器的正常工作[18]。相比与干旱胁迫，高温胁迫造成的体内MDA积累的时间较晚，避免了植物细胞因膜系统损伤，进一步影响细胞功能的情况。植物遭受逆境胁迫时，体内活性氧的积累会造成细胞伤害甚至死亡[19]。而在不断适应逆境的过程中，植物自身形成了一套清除自由基或活性氧的保护酶体系。逆境下植物维持体内抗氧化酶活性的能力是影响其生存的重要因素之一。其中，SOD可以催化活性氧分解形成过氧化氢与氧气；POD主要用来催化H2O2与酚类的反应，同时与CAT共同作用催化H2O2形成水，从而有效减少活性氧的积累[20]。高温和干旱双重胁迫三天后，由于SOD、POD和CAT活性的快速下降，植物体内产生的过氧化物无法及时被清除，加速了植株受损的过程。高温处理下L-93叶片SOD酶活性的明显上升有助于延缓过氧化物对植物造成进一步伤害。高温与干旱多是伴随出现，高温能引起干旱，从而带来水分的缺失，水分的缺失是引起植物各项指标发生变化的最直接与主要的因素。所以相比于高温胁迫，干旱胁迫引起植物抗氧化代谢变化发生的时间更短，幅度更大。而在双重胁迫下，高温加强了植物的蒸腾作用，干旱带来水分的缺失，所以，各项指标的发生时间与幅度都远远比单胁迫下更短、更大。致谢论文的顺利完成离不开各位师兄师姐、同学和朋友的关心和帮助，在这特别感谢园艺学院研究生、我的师兄曲亚楠，在整个实验过程中，他一直耐心的指导我，帮助我克服了一个一个的困难和疑惑，正在撰写硕士研究生毕业论文的他，在百忙之中抽出时间帮助我搜集文献资料，帮助我理清论文写作思路，对我的论文提出了诸多宝贵的意见和建议，对师兄的帮助表示真挚的感谢。感谢在一起愉快的渡过毕业论文小组的同学臧君诚、李胜男、吴雯雯在实验、学习和生活中的大力协助与支持。感谢室友李晓栋、白保辉、耿牧帆、范彬彬、郑骏阳在生活中给予的关心和帮助，在此谨一并致以诚挚的谢意!特别感谢我父母、家人和亲友这些年来在精神和生活上给予我的全力支持和无私关爱，多年来他们给予我充分的支持、理解和信心，是我顺利完成学业的坚强后盾和感情支柱，在此表示深深的感谢!参考文献[1] 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目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言（或绪论）3
1材料与方法4
1.1 材料 4
1.2 试验处理4
1.3 测定指标和方法4
1.3.1 叶片相对含水量4
1.3.2 叶片膜透性5
1.3.3丙二醛 5
1.3.4抗氧化物酶5
1.4 试验数据处理5
2 结果与分析5
2.1 叶片相对含水量变化5
2.2 叶片膜透性变化6
2.3叶片丙二醛含量变化7
2.4叶片抗氧化酶含量的变化7
2.4.1 超氧化物歧化酶7
2.4.2 过氧化物酶8
2.4.3过氧化氢酶9
3 总结9
致谢10
参考文献10
翦股颖草坪草在高温与干旱胁迫下抗氧化代谢的变化
引言
crease with prolonged treatment. Combined stresses most serious damage to the plant,?leaf relative water content and antioxidant enzyme activity rapidly decreased, MDA have a large increase in a short period of time. In the?single stress,?drought caused relative water content and enzymes for antioxidant decreased more obvious, and electrolyte leakage and MDA changed earlier.匍匐翦股颖(Agrostis stolonifera L.)为禾本科翦股颖属多年生草本植物，俗名本特草、四季青，是一种冷季型草坪草。翦股颖具有绿期长、矮生、叶细、株密的优异特性，质量超过其他任何冷季型草坪草，且质地细软、恢复能力强，耐频繁低剪，成为最具应用潜力的种质资源之一 ，因此在我国园林绿化中有着广泛的应用[1]。在我国气候过渡地区，夏季高温，并伴随降水的减少，使高温和干旱双重胁迫成为制约草坪草生长的主要因素[2]。逆境胁迫对草坪草造成的伤害主要体现在草坪景观质量下降；叶片相对含水量下降，出现叶片萎蔫甚至干枯；叶绿素分解速度加快，叶色逐步呈现枯黄；叶片细胞膜稳定性遭到破坏；叶片中短时间内出现大量丙二醛积累等，而生理结构上的损伤多由于植株体内氧化物质积累造成[3]。在多重胁迫环境下，高温胁迫加剧干旱胁迫，植物失水速度提高，叶片枯黄面积增大，草坪质量迅速降低，植株短时间内会出现大面积死亡[4]。植物在逆境胁迫时体内活性氧增加，导致脂质过氧化，使细胞膜系统受到伤害，从而严重影响生物膜的功能[5]。当活性氧的累积超过一定域值时，促使膜脂中不饱和脂肪酸过氧化产生丙二醛( MDA ), MDA能与酶蛋白发生链式反应聚合，使膜系统变性。因此，MDA可作为活性氧造成膜脂过氧化的主要产物之一，可作为衡量脂质过氧化程度的指标，其含量的多少与植物的抗逆性有着紧密的关系[6]。而堪称植物膜保护的三大酶系，即超氧化物歧化酶( SOD )、过氧化物酶( POD)和过氧化氢酶( CAT)，都具有清除活性氧自由基的作用，提高植物对不利环境的适应能力 [7]。目前已有一些关于高温干旱双重胁迫的报道，高温与干旱多是同时存在的[8]。万里强等选取多年生黑麦草作为试验材料，观察了叶绿体和线粒体超微结构的变化，结果显示，耐热抗旱性较强的品种叶绿体受损程度较轻[9]。刘晓军等以苇状羊茅为材料，研究了干热胁迫下，苇状羊茅对不同水肥条件的响应机理[10]。而有关双重胁迫对草坪草抗氧化系统影响的研究研究报道较少。草坪草生长在多变的环境中，往往会同时或相继遭受不同逆境的影响，在长期适应中形成对不同逆境双重适应的特性。本研究利用人工气候箱模拟干旱与高温环境，观察和比较了在不同胁迫下，冷季型草坪草匍匐翦股颖抗氧化代谢的变化规律，揭示冷季型草坪草应对温度升高和水分亏缺的生化机理，为培育抗热抗旱型草坪草新品种提供理论依据。1.材料与方法1.1材料试验在大学牌楼实验教学基地的温室内进行。试验材料选取常见冷季型草坪草匍匐翦股颖L-93。材料培养初期，采用5 g/㎡的种植密度将种子播撒在容器中；种子萌发3个月后移入温室内进行扩繁生长。9个月过后，选取生长状况一致，长势良好的植株作为试验材料，移入高20cm，直径15cm的塑料盆中进行实验。栽培基质为草炭沙 = 2:1。材料培养期间，每周施用一次1/2倍的Hogland营养液。试验处理试验采取随机区组设计，处理分为对照处理、高温处理、干旱处理以及高温干旱双重胁迫处理。每个处理设置四盆重复，每盆移入20棵L-93植株。材料提前一星期放入人工气候箱内进行适应性生长，箱内控制湿度50%，光照12000 lux。具体处理方法对照处理，昼温25 ℃/夜温15 ℃，光周期12 h/12 h，每三天补水一次，每个塑料盆补水500 ml。高温处理，昼温35 ℃/夜温25 ℃，光周期12 h/12 h。每三天补水一次，每个塑料盆补水500 ml。干旱处理，昼温25 ℃/夜温15 ℃，光周期12 h/12 h。自然干旱，不进行任何形式的补水。双重逆境处理，昼温35 ℃/夜温25℃，光周期12 h/12 h。试验期间不进行任何形式的补水。测定指标及方法试验样品的采集与指标的测定每3天进行一次，整个过程共进行4次重复。1.3.1 叶片相对含水量剪取新鲜叶片0.2 g，wf；将取得的叶片组织浸泡于去离子水中24 h，取出用吸水纸擦干表面水分，称取其饱和重wt；随后将叶片转移至80 ℃烘箱内烘24 h，冷却至室温后称取其干重，wd。相对含水量=（wf﹣wd）/（wt﹣wd）*100%1.3.2 叶片膜透性采取相对电导率法[11]，将叶片浸泡于装有去离子水的50 ml离心管中，震荡24小时后测定电导率率值，E0；随后将离心管放入水浴中，煮沸后测定电导率值，Eb。相对电导率= E0/Eb*100%1.3.3 丙二醛（MDA）丙二醛（MDA）含量测定，采用李合生的巴比妥酸（TBA）显色法测定[12]。取0.5 g叶片，加入5% TCA 5 ml，研磨后所得匀浆在3000 r/min下离心10 min。取上清液2 ml，加入0.67% TBA 2 ml，混合后在100℃水浴上煮沸30 min，冷却后再离心一次。分别测定上清液在450 nm、532 nm、和600 nm处的吸光值A。丙二醛浓度C(μmol/L)=6.45(A532﹣A600)﹣0.56 A4501.3.4抗氧化物酶取叶片0.5 g，加入液氮研磨成粉末状后溶解于4 ml磷酸缓冲液（pH 7.8,0.05 mol/L），在4℃、12000 r/min下离心20 min，得到的上清液放入4℃条件下保存，用于测定超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）的活性。SOD活性采取氮蓝四唑（NBT）还原法测定[11]取50μL酶液，加入混合反应液，含0.05 mol/L磷酸缓冲液、0.13 mol/L Met溶液、750 μmol/L NBT溶液、100 μmol/L EDTA-Na2溶液、20μmol/L核黄素溶液，以不加酶液作为对照，测量560 nm处的吸光值。POD活性测定通过愈创木酚法测定[11-12]取40μL酶液，加入反应液含50 ml 0.2mol/L pH 6.0的磷酸缓冲液、28μL愈创木酚、19μL 30% H2O2溶液，以磷酸缓冲液作对照，测量470nm处的吸光值。CAT活性的测定[11-12]取0.1 mL酶液，加入2.9 mL反应液，以磷酸缓冲液作对照，测定1 min内240 nm处吸光值的变化。反应液中含有100 mL 0.05 mol/L pH 7.0的磷酸缓冲液、0.1546 ml 30% H2O2溶液。试验测定使用的紫外分光光度计为美国通用GE Ultrospec 9000型。试验数据处理采用SPSS13.0进行数据处理与分析，LSD法检验差异显著性（P <0.05）。2.结果与分析2.1 叶片相对含水量变化图1. 不同胁迫对叶片相对含水量的影响（LN:对照组；LND:干旱处理；LH:高温处理；LHD:高温干旱处理）Fig.1 Relative water content as affected by drought (LND), heat (LH) and combined stresses (LHD) in leaves of creeping bentgrass如图1所示，高温干旱双重胁迫处理后叶片相对含水量迅速下降，处理3 d就下降至24%；干旱处理3 d的后叶片含水量下降，但与对照处理及高温处理并无显著差异，处理6 d后，叶片含水量大幅下降至36%，并随处理时间增加而维持不变；高温处理6 d后叶片含水量与对照处理仍无显著差异，但9 d后出现明显下降趋势，叶片相对含水量下降到57%。胁迫处理结束后叶片相对含水量由高到低依次是对照组、高温处理、干旱处理、双重胁迫处理。2.2叶片膜透性变化图2. 不同胁迫对叶片相对电导率的影响（LN:对照组；LND:干旱处理；LH:高温处理；LHD:高温干旱处理）Fig.2 Electrolyte leakage as affected by drought (LND), heat (LH) and combined stresses (LHD) in leaves of creepingbentgrass从图2可以看出，高温干旱双重胁迫下叶片电导率增加速度明显高于其他处理，并在处理6 d后趋于稳定；高温处理6 d后叶片相对电导率并无显著变化，但9 d后电导率急速增大。干旱处理3 d到6 d期间，叶片相对电导率从37%显著增加至83%。试验结果表明，高温干旱处理与干旱处理对膜透性的影响无显著差异，高温处理造成的影响明显小于前两者。2.3叶片丙二醛含量变化图3. 不同胁迫对丙二醛（MDA）含量的影响（LN:对照组；LND:干旱处理；LH:高温处理；LHD:高温干旱处理）Fig.3 MDA as affected by drought (LND), heat (LH) and combined stresses (LHD) in leaves of creeping bentgrass如图3所示，遭受各种逆境胁迫时，植株体内MDA的含量均上升。在高温干旱胁迫下，叶片中MDA含量在处理开始后即呈现持续快速上升的趋势；干旱处理第3 d叶片才开始出现明显的丙二醛累积，与高温干旱处理相比上升幅度较小；高温处理第6 d丙二醛含量才显著增加。处理9 d后，叶片中丙二醛含量由高到低依次为高温干旱处理、干旱处理、高温处理、对照处理，其中高温处理和干旱处理之间没有显著差异。2.4 叶片抗氧化酶含量变化2.4.1 超氧化物歧化酶（SOD）图4. 不同胁迫超氧化物歧化酶（SOD）活性的影响（LN:对照组；LND:干旱处理；LH:高温处理；LHD:高温干旱处理）Fig.4 SOD activity in creeping bentgrass in response to drought (LND), heat (LH) and combined stresses (LHD) in creeping bentgrass如图4所示，各胁迫处理第3 d，SOD酶活性均显著增加，高温干旱处理下SOD酶活性显著高于其他三个处理。处理第6 d，各胁迫处理的SOD酶活性显著降低，并均低于对照水平；处理9 d后，干旱处理下SOD酶活性增加。叶片中SOD酶的活性依次为对照处理、干旱处理、高温干旱处理、高温处理。2.4.2 过氧化物酶（POD）图5.不同胁迫对过氧化物酶（POD）活性的影响（LN:对照组；LND:干旱处理；LH:高温处理；LHD:高温干旱处理）Fig.5 POD activity in creeping bentgrass in response to drought (LND), heat (LH) and combined stresses (LHD) in creeping bentgrass由图5可以看出，各种胁迫处理后POD活性均随处理时间的增加呈现大幅度降低趋势。降低的幅度，高温干旱处理远大于高温处理和干旱处理。处理9 d后，高温胁迫和干旱胁迫处理的POD活性远低于对照处理水平，远高于高温干旱胁迫处理，但两者之间差异并不显著。2.4.3 过氧化氢酶（CAT）图6.不同胁迫对过氧化氢酶（CAT）活性的影响（LN:对照组；LND:干旱处理；LH:高温处理；LHD:高温干旱处理）Fig.6 CAT activity in creeping bentgrass in response to drought (LND), heat (LH) and combined stresses (LHD) in creeping bentgrass由图6可以看出，胁迫降低CAT活性。双重胁迫处理的活性下降程度最为明显。9 d后叶片中CAT的活性由高到低依次为对照处理、高温处理、干旱处理、高温干旱处理。 3.讨论叶片相对含水量常用于衡量植物在逆境中的生长状况，叶片组织内水分状况的稳定有利于维持植物体内正常生理生化反应的运行[13]。高温胁迫发生时,对植物构成水分胁迫,使植物出现脱水现象，从而对植物的膜系统产生次生胁迫[14]。原生质膜是细胞内外的一层屏障,可以有效地防御逆境引起的伤害, 从而维持细胞结构的稳定性。当植物处于干旱胁迫时,原生质膜对干旱最为敏感，首先感受到外界环境条件的变化。 原生质膜的组成和结构发生明显变化，导致细胞内含物质大量外渗, 电导率增大。 胁迫程度越大,原生质膜受损害越大。干旱胁迫处理的L-93在处理第三天叶片相对含水量显著下降。高温处理下的L-93能较长时间保证叶片相对含水量的稳定，延缓了胁迫对其他生理结构造成伤害，这也充分说明了水分的缺失是造成植物胁迫最直接的因素。高温干旱双重胁迫处理时，一方面由于水分无法得到及时补充造成细胞脱水，另一方面高温加强了植物的蒸腾作用，结果导致L-93叶片相对含水量下降的时间点大幅提前[15]。丙二醛（MDA）作为活性氧造成膜脂过氧化的主要产物之一，可作为衡量脂质过氧化程度的指标，其含量的多少与植物的抗逆性有着紧密的关系 [16]。大量的MDA积累会造成膜系统损伤甚至变性，加深逆境对植株造成的伤害[17]。叶片相对含水量的降低以及抗氧化酶活性的下降都会导致MDA含量的上升[17]。高温干旱双重胁迫使叶片内MDA含量短时间内迅速增加，叶片电导率增加，细胞膜透性受到严重影响。MDA含量过高会影响线粒体，叶绿体等其他细胞器的正常工作[18]。相比与干旱胁迫，高温胁迫造成的体内MDA积累的时间较晚，避免了植物细胞因膜系统损伤，进一步影响细胞功能的情况。植物遭受逆境胁迫时，体内活性氧的积累会造成细胞伤害甚至死亡[19]。而在不断适应逆境的过程中，植物自身形成了一套清除自由基或活性氧的保护酶体系。逆境下植物维持体内抗氧化酶活性的能力是影响其生存的重要因素之一。其中，SOD可以催化活性氧分解形成过氧化氢与氧气；POD主要用来催化H2O2与酚类的反应，同时与CAT共同作用催化H2O2形成水，从而有效减少活性氧的积累[20]。高温和干旱双重胁迫三天后，由于SOD、POD和CAT活性的快速下降，植物体内产生的过氧化物无法及时被清除，加速了植株受损的过程。高温处理下L-93叶片SOD酶活性的明显上升有助于延缓过氧化物对植物造成进一步伤害。高温与干旱多是伴随出现，高温能引起干旱，从而带来水分的缺失，水分的缺失是引起植物各项指标发生变化的最直接与主要的因素。所以相比于高温胁迫，干旱胁迫引起植物抗氧化代谢变化发生的时间更短，幅度更大。而在双重胁迫下，高温加强了植物的蒸腾作用，干旱带来水分的缺失，所以，各项指标的发生时间与幅度都远远比单胁迫下更短、更大。致谢论文的顺利完成离不开各位师兄师姐、同学和朋友的关心和帮助，在这特别感谢园艺学院研究生、我的师兄曲亚楠，在整个实验过程中，他一直耐心的指导我，帮助我克服了一个一个的困难和疑惑，正在撰写硕士研究生毕业论文的他，在百忙之中抽出时间帮助我搜集文献资料，帮助我理清论文写作思路，对我的论文提出了诸多宝贵的意见和建议，对师兄的帮助表示真挚的感谢。感谢在一起愉快的渡过毕业论文小组的同学臧君诚、李胜男、吴雯雯在实验、学习和生活中的大力协助与支持。感谢室友李晓栋、白保辉、耿牧帆、范彬彬、郑骏阳在生活中给予的关心和帮助，在此谨一并致以诚挚的谢意!特别感谢我父母、家人和亲友这些年来在精神和生活上给予我的全力支持和无私关爱，多年来他们给予我充分的支持、理解和信心，是我顺利完成学业的坚强后盾和感情支柱，在此表示深深的感谢!参考文献[1] 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目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言（或绪论）3
1材料与方法4
1.1 材料 4
1.2 试验处理4
1.3 测定指标和方法4
1.3.1 叶片相对含水量4
1.3.2 叶片膜透性5
1.3.3丙二醛 5
1.3.4抗氧化物酶5
1.4 试验数据处理5
2 结果与分析5
2.1 叶片相对含水量变化5
2.2 叶片膜透性变化6
2.3叶片丙二醛含量变化7
2.4叶片抗氧化酶含量的变化7
2.4.1 超氧化物歧化酶7
2.4.2 过氧化物酶8
2.4.3过氧化氢酶9
3 总结9
致谢10
参考文献10
翦股颖草坪草在高温与干旱胁迫下抗氧化代谢的变化
引言
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