凹土复配剂对辣椒氮素同化及关键酶活性的影响
目 录
1 引言1
2 材料与方法1
2.1 供试材料1
2.2 试验设计1
2.3 测定内容和方法2
2.3.1 氮素同化酶活性2
2.3.2 植株全氮、全磷、全钾、氨态氮、硝态氮3
2.4 统计分析4
3 结果与讨论4
3.1 不同凹土复配剂对N素同化关键酶的影响4
3.1.1 硝酸还原酶（NR）4
3.1.2 谷氨酰胺合成酶（GS）5
3.2 不同凹土复配剂对辣椒N、P、K含量的影响6
3.2.1 N素6
3.2.2 P素10
3.2.3 K素11
3.3 讨论12
结论14
致谢15
参考文献161 引言
凹土又称作是凹凸棒面粘土、凹凸棒石粘土等,是一种以凹凸棒石为主要成分的粘土性矿物[1]。凹土主要的成分是坡缕石或者坡缟石, 是一种带结晶水的镁铝硅酸盐粘土性矿物,隶属海泡石族, 属于1:2型的层链式状晶体结构[2]；除凹凸棒石外, 一般还共生有蒙脱石、SiO2、蛋白石、海泡石、CO32-盐等矿产物[3]。粘土大致呈粉末状, 颗粒为45～80 μm, 比表面积约是425 m2/g[4]。凹土的结构特征赋予了其独树一帜的吸附性、流变能力、离子交换、催化、填充等性能[5],在石油、化工、建材、医药、农业和环保等领域的应用十分广泛[6]；而凹土作为一种重要的稀缺性非金属矿物质资源，其在盱眙资源量占世界储量约为49%、是我国的74%[7]。凹凸棒石粘土是中国优势非金属矿物质之一，其用途相当广泛，被称作是“千用之土”[8]。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
研究认为，辣椒连作会对自身造成毒害[9]，其中最为重要因素就是化感物质的影响[10]，耿广东、程智慧等研究认为，DBP是辣椒主要的化感物质之一[11]，也是目前农田土壤中最容易被检测出的有机污染物之一[12]。21世纪以来，凹土常被用于土壤的改良与修复[13]，对土壤连作障碍以及植株自毒作用也有着明显的益处，Liu[14],任旭琴等[15]发现，凹土作为修复剂时，其修复效果取决于其吸附性以及与土壤环境的互作性，而当凹土的添加计量控制在20～40 g/kg时，其对辣椒自毒作用的修复效果较好。
本研究通过将凹土与不同组分进行复配，应用于塑料大棚辣椒连作土壤中，探讨了不同处理对辣椒N素同化及关键酶活性的影响，以期弄清楚不同处理对N素吸收和运转的影响，为有效解决辣椒连作障碍提供理论依据。
2 材料与方法
2.1 供试材料
本试验以红巨椒为辣椒品种。草木灰从生物质发电厂购买，菌剂从康源绿洲生物科技有限公司购买，主要成分为光合菌、乳酸菌和酵母菌为主的多种有益微生物复合制剂。
2.2 试验设计
试验采用随机区组试验设计方法，高平畦种植，每667m2施有机肥 1000kg，复合肥50 kg,辣椒株行距40×50 cm，大棚土壤采用如下处理有：
1）草木灰（100 kg/667m2）处理，用T1表示。
2）凹土（50 kg/667m2）+草木灰（100 kg/667m2）+菌剂（100 mL/667m2）处理，用T2表示。
3）凹土（50 kg/667m2）+菌剂（100 mL/667m2，每mL含总菌数在200亿以上，含固氮菌、光合菌等多种，具体见产品说明）处理，用T3表示。
以不施以上任何为对照 ，用CK表示，各个处理以基肥形式施入土壤。每个处理重复3次。
测定果实旺盛期辣椒根系和叶片中的氮素同化酶活性和根、茎、叶中的全氮、全磷、全钾、氨态氮、硝态氮等指标。
2.3 测定内容和方法
2.3.1 氮素同化酶活性
（1）粗酶液的制备
取0.5g根系，加入2ml预冷的酶提取缓冲液（pH7.5的20 mmol.L-1 hepes-NaOH缓冲液，含0.5 mmol.L-1 β-硫基乙醇；5 mmol/L EDTA；2 mmol.L-1 MgCL2；0.5 mmol.L-1 PMSF；2.5 mmol.L-1 DTT；0.05% Triton-100；2%PVP），冰浴研磨，匀浆在4℃，12000 r/min，离心15 min，收集上清液。
（2）硝酸还原酶（NR）活性的测定
取酶粗提取液0.5 mL，加入pH7.5 0.1 mol/L 磷酸缓冲液 0.5 mL，1mg/mL NADH O.5 mL，1 mg/ml KNO3 1 mL，定容至10 mL。于28摄氏度预培养15 min后加入1%氨基苯磺酰胺5 mL，0.02%萘基乙烯二胺水溶液5 mL终止其反应。反应混合液在5000 r/min离心5 min后，在540 nm处测定吸光值，空白对照不加NADH，用0.1 mL水代替（以28℃下，每克鲜物质每小时催化生成的亚硝酸盐量为一个酶活力单位U）。
（3）谷氨酰胺合成酶（GS）活性的测定< *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
br /> 取酶提取液1.2 mL，加入0.6 mL 0.25 mol/L咪唑-盐酸缓冲液（pH7.0），0.4 mL谷氨酸钠溶液（pH7.0），0.4 mL 30 mmol/L ATP-Na溶液（pH7.0），0.2 mL 0.6 mol/L羟胺，0.2 mL 0.5 mol/L MgSO4，反应液在37摄氏度水浴保温15 min后，加入0.8 mLFeCl3终止反应。混合液于4000 r/min离心15 min，上清液在540nm处测定吸光度。（GS活力=A/（w×t））
2.3.2 植株全氮、全磷、全钾、氨态氮、硝态氮
（1）植株消煮
采用硫酸-过氧化氢消煮法，取烘干、磨细的植物样品0.25g，置于100mL消煮管中，加入浓硫酸5mL并摇匀，加一弯颈漏斗，在消化炉上先缓慢加热，再提高温度[16]。待消煮液呈现均匀棕黑色时，取下消煮管，滴加30%过氧化氢溶液10滴，并不断摇动消煮管，反复进行3～5次，每次添加的过氧化氢溶液应逐次递减，消煮至溶液呈无色或清亮状态后，再加热5min取下，冷却后用少量水冲洗，洗液流入消煮管之中。将消煮液完好无损地洗入250 ml规格容量瓶之中，用水定容后摇匀。过滤或放置澄清以后供N、P、K地相关测定[17]。
（2）铵态氮、硝态氮测定
吸取5 mL消煮液于50 mL容量瓶中；加入1 mL EDTA-甲基红（1.6gEDTA溶解，定容到50 mL，再加入0.25%甲基红酒精溶液1 mL）溶液，用0.3 mol/L的氢氧化钠调节PH到6，颜色由红变黄；加入1%苯酚5 mL，1%次氯酸钠5 mL；放置1 h，在625 nm下比色。
1 引言1
2 材料与方法1
2.1 供试材料1
2.2 试验设计1
2.3 测定内容和方法2
2.3.1 氮素同化酶活性2
2.3.2 植株全氮、全磷、全钾、氨态氮、硝态氮3
2.4 统计分析4
3 结果与讨论4
3.1 不同凹土复配剂对N素同化关键酶的影响4
3.1.1 硝酸还原酶（NR）4
3.1.2 谷氨酰胺合成酶（GS）5
3.2 不同凹土复配剂对辣椒N、P、K含量的影响6
3.2.1 N素6
3.2.2 P素10
3.2.3 K素11
3.3 讨论12
结论14
致谢15
参考文献161 引言
凹土又称作是凹凸棒面粘土、凹凸棒石粘土等,是一种以凹凸棒石为主要成分的粘土性矿物[1]。凹土主要的成分是坡缕石或者坡缟石, 是一种带结晶水的镁铝硅酸盐粘土性矿物,隶属海泡石族, 属于1:2型的层链式状晶体结构[2]；除凹凸棒石外, 一般还共生有蒙脱石、SiO2、蛋白石、海泡石、CO32-盐等矿产物[3]。粘土大致呈粉末状, 颗粒为45～80 μm, 比表面积约是425 m2/g[4]。凹土的结构特征赋予了其独树一帜的吸附性、流变能力、离子交换、催化、填充等性能[5],在石油、化工、建材、医药、农业和环保等领域的应用十分广泛[6]；而凹土作为一种重要的稀缺性非金属矿物质资源，其在盱眙资源量占世界储量约为49%、是我国的74%[7]。凹凸棒石粘土是中国优势非金属矿物质之一，其用途相当广泛，被称作是“千用之土”[8]。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
研究认为，辣椒连作会对自身造成毒害[9]，其中最为重要因素就是化感物质的影响[10]，耿广东、程智慧等研究认为，DBP是辣椒主要的化感物质之一[11]，也是目前农田土壤中最容易被检测出的有机污染物之一[12]。21世纪以来，凹土常被用于土壤的改良与修复[13]，对土壤连作障碍以及植株自毒作用也有着明显的益处，Liu[14],任旭琴等[15]发现，凹土作为修复剂时，其修复效果取决于其吸附性以及与土壤环境的互作性，而当凹土的添加计量控制在20～40 g/kg时，其对辣椒自毒作用的修复效果较好。
本研究通过将凹土与不同组分进行复配，应用于塑料大棚辣椒连作土壤中，探讨了不同处理对辣椒N素同化及关键酶活性的影响，以期弄清楚不同处理对N素吸收和运转的影响，为有效解决辣椒连作障碍提供理论依据。
2 材料与方法
2.1 供试材料
本试验以红巨椒为辣椒品种。草木灰从生物质发电厂购买，菌剂从康源绿洲生物科技有限公司购买，主要成分为光合菌、乳酸菌和酵母菌为主的多种有益微生物复合制剂。
2.2 试验设计
试验采用随机区组试验设计方法，高平畦种植，每667m2施有机肥 1000kg，复合肥50 kg,辣椒株行距40×50 cm，大棚土壤采用如下处理有：
1）草木灰（100 kg/667m2）处理，用T1表示。
2）凹土（50 kg/667m2）+草木灰（100 kg/667m2）+菌剂（100 mL/667m2）处理，用T2表示。
3）凹土（50 kg/667m2）+菌剂（100 mL/667m2，每mL含总菌数在200亿以上，含固氮菌、光合菌等多种，具体见产品说明）处理，用T3表示。
以不施以上任何为对照 ，用CK表示，各个处理以基肥形式施入土壤。每个处理重复3次。
测定果实旺盛期辣椒根系和叶片中的氮素同化酶活性和根、茎、叶中的全氮、全磷、全钾、氨态氮、硝态氮等指标。
2.3 测定内容和方法
2.3.1 氮素同化酶活性
（1）粗酶液的制备
取0.5g根系，加入2ml预冷的酶提取缓冲液（pH7.5的20 mmol.L-1 hepes-NaOH缓冲液，含0.5 mmol.L-1 β-硫基乙醇；5 mmol/L EDTA；2 mmol.L-1 MgCL2；0.5 mmol.L-1 PMSF；2.5 mmol.L-1 DTT；0.05% Triton-100；2%PVP），冰浴研磨，匀浆在4℃，12000 r/min，离心15 min，收集上清液。
（2）硝酸还原酶（NR）活性的测定
取酶粗提取液0.5 mL，加入pH7.5 0.1 mol/L 磷酸缓冲液 0.5 mL，1mg/mL NADH O.5 mL，1 mg/ml KNO3 1 mL，定容至10 mL。于28摄氏度预培养15 min后加入1%氨基苯磺酰胺5 mL，0.02%萘基乙烯二胺水溶液5 mL终止其反应。反应混合液在5000 r/min离心5 min后，在540 nm处测定吸光值，空白对照不加NADH，用0.1 mL水代替（以28℃下，每克鲜物质每小时催化生成的亚硝酸盐量为一个酶活力单位U）。
（3）谷氨酰胺合成酶（GS）活性的测定< *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
br /> 取酶提取液1.2 mL，加入0.6 mL 0.25 mol/L咪唑-盐酸缓冲液（pH7.0），0.4 mL谷氨酸钠溶液（pH7.0），0.4 mL 30 mmol/L ATP-Na溶液（pH7.0），0.2 mL 0.6 mol/L羟胺，0.2 mL 0.5 mol/L MgSO4，反应液在37摄氏度水浴保温15 min后，加入0.8 mLFeCl3终止反应。混合液于4000 r/min离心15 min，上清液在540nm处测定吸光度。（GS活力=A/（w×t））
2.3.2 植株全氮、全磷、全钾、氨态氮、硝态氮
（1）植株消煮
采用硫酸-过氧化氢消煮法，取烘干、磨细的植物样品0.25g，置于100mL消煮管中，加入浓硫酸5mL并摇匀，加一弯颈漏斗，在消化炉上先缓慢加热，再提高温度[16]。待消煮液呈现均匀棕黑色时，取下消煮管，滴加30%过氧化氢溶液10滴，并不断摇动消煮管，反复进行3～5次，每次添加的过氧化氢溶液应逐次递减，消煮至溶液呈无色或清亮状态后，再加热5min取下，冷却后用少量水冲洗，洗液流入消煮管之中。将消煮液完好无损地洗入250 ml规格容量瓶之中，用水定容后摇匀。过滤或放置澄清以后供N、P、K地相关测定[17]。
（2）铵态氮、硝态氮测定
吸取5 mL消煮液于50 mL容量瓶中；加入1 mL EDTA-甲基红（1.6gEDTA溶解，定容到50 mL，再加入0.25%甲基红酒精溶液1 mL）溶液，用0.3 mol/L的氢氧化钠调节PH到6，颜色由红变黄；加入1%苯酚5 mL，1%次氯酸钠5 mL；放置1 h，在625 nm下比色。
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