转录因子spl9在葡萄果实发育过程中的功能分析
[目的]探讨转录因子SPL9在葡萄果实发育过程中的作用。[方法]以“藤稔”葡萄为材料，结合 qRT-PCR 技术手段、番茄瞬时转基因等方法阐释SPL(SQUAMOSA promoter binding protein-like) 转录因子基因SPL9调控葡萄果实发育成熟的分子机制。通过PCR的方法从葡萄品种“藤稔”果实中克隆出SPL9基因的 cDNA 全长序列，并通过qRT-PCR分析SPL9在葡萄不同生长时期表达量，并进行了SPL9的植物双元表达载体的构建和番茄基因瞬时表达的实验。[结果]结果表明，在葡萄的不同生长时期SPL9的表达量随着果实发育不断的增加。通过番茄瞬时表达技术表明SPL9参与了果实的发育上色成熟进程，推测SPL9对葡萄果实的生长发育具有重要的调控作用。[结论]转录因子SPL9对葡萄果实发育成熟具有重要作用。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法3
1.1 试验材料 3
1.2 葡萄果实RNA提取 3
1.3 mRNA的分离与纯化3
1.4 实时荧光定量PCR分析3
1.5 超表达载体构建及果实瞬时表达体系3
1.5.1 感受态细胞的制备——氯化钙法3
1.5.2 重组质粒的转化3
1.5.3 质粒的小量制备——碱裂解法制备4
1.5.4 感受态的制备4
1.5.5 转化农杆菌4
1.5.6 农杆菌侵染4
1.6 生物学信息分析5
2 结果与分析5
2.1 SPL9基因序列和蛋白质序列的特征5
2.2 不同物种的初步进化分析7
2.3 SPL9在果实发育过程中的表达趋势及意义8
2.4基因SPL9可能促进葡萄早熟8
3 讨论 9
致谢10
参考文献10
转录因子SPL9在葡萄果实发育过程中的功能分析
引言
葡萄是葡萄科葡萄属藤本植物，它本身营养丰富，人们对它有很高的赞誉。根据联合国粮食及 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
农业组织报道，葡萄栽培的面积始终在各类水果中保持第一，其生产量居各种水果的前几位。葡萄不仅是世界上四大水果之一，其栽培在我国历史十分悠久，中国也是一个大型的葡萄种植国家，根据新鲜葡萄产量的计算，中国已多年在世界上排名第一。除了可以作为新鲜水果来使用，而且可以用作酿造酒，制作果汁和葡萄干等加工食品的原料。葡萄具有较高营养，它含有很多矿物质元素、各种氨基酸和蛋白质等营养物质 [1]。调控葡萄果实成熟对葡萄的鲜食、保鲜贮藏和加工产品质量好坏都十分关键。近些年来，我国设施葡萄产业飞快发展，葡萄促成和延迟栽培技术应用越来越普遍。尽管这些栽培模式取得一定的收益，但促成或延迟成熟期后往往会伴随着葡萄果实品质的下降。产生这种情况的是有多种原因造成的，“对葡萄果实成熟的分子机理认识还不够充分，从而不能更科学地采取栽培措施调控葡萄果实发育成熟过程”可能是主要原因之一。
转录因子（Transcription factor, TF），也称反式作用因子，是一类可通过直接或间接与基因启动子区域中顺式作用元件发生特异性的相互作用，来调节基因表达的一类蛋白质分子[26]。至今，基本上在所有生物体中都检测到了转录因子的存在，且在许多生物的发育过程中都起着十分关键的作用。在植物中，也已经鉴定出了MYB、WRKY、bZIP等许多的转录因子家族。他们在调节植物的生长、分化、代谢以及对环境胁迫的应答方面扮演着不可或缺的角色。
SPL (SQUAMOSA promoter binding proteinlike)是一类植物特有的具有多功能的转录因子，广泛存在于绿色植物中，具有高度保守的DNA结合区域SBP结构域。在模式植物拟南芥里共发现17个SPL基因，水稻中有19个SPL基因[2]。初步网络和相互作用组分析表明，SPL基因通过调节其它转录因子发挥它们的功能，并且还可以参与葡萄糖，无机盐，和三磷酸腺苷（ATP）的产量的基础代谢过程[24]。越来越多的研究表明，SPL家族参与了植物的生长发育、代谢调节及非生物胁迫等多种生物过程，成为植物生长发育的调控枢纽[4]，在赤霉素响应、叶片发育、细胞凋亡、发育阶段转换、花和果实发育、光信号转导、育性、顶端优势、植物形态建设、间隔期长度、花青素积累、调控植物胚胎发育及体内铜离子稳态平衡等方面发挥重要作用[5]。许多SPL基因转录物上的miRNA响应元件（MRE）的存在预示着SPL基因与miRNA具有广泛相互作用，17个AtSPL中有11个被认为存在高度相似的miR156和miR157的识别位点[25]。具有或不具有miRNA的多种SPL功能和作用模式表现出植物生长和发育潜在的复杂的调控网络，当然，除了植物生长发育外也可能是其他过程，如应激反应和基础代谢[2]。在模式植物拟南芥中，拟南芥SPL蛋白的大小是不同的，范围从最少的131个氨基酸（AtSPL3）到927个氨基酸（AtSPL12）不等[6]。不同AtSPL基因在发育的不同阶段和不同组织部位单独或共同发挥各种作用，参与拟南芥花的发育[6] [7] [8]、调控GA合成[8]、营养生长和开花的转换[9]、叶片发生等[10]、叶片性状[13]、间隔期长度[12]等诸多发育过程。
果实发育成熟是一个复杂的过程，其中涉及到植物各组织各部分各种的生理和生化过程的分子调控。近来的研究发现SPL是调节和控制植物各个生长阶段的多种生物过程尤其是果实发育成熟的重要转录因子之一。拟南芥AtSPL10决定拟南芥的果荚的长度[13]。水稻OsSPL16可以影响水稻米粒大小、色泽、形状以及产量，提高OsSPL16的表达水平能促进增值胚乳细胞和充实籽粒，且增大粒宽、粒重和水稻产量。降低OsSPL16的表达水平则会使籽粒变得细长，增加胚乳的透明度，减小水稻的垩白率，让稻米外观品质更美观[14] [15]。玉米的籽粒稃壳发育也受玉米SPL基因的控制 [13] [41] [15] [19]。影响番茄成熟一个重要基因是番茄的 LeSPLCNR，该基因的启动子区发生表观变异时，会造成果皮类胡萝卜素的细胞壁结构与生物合成，从而延缓果实成熟[17]。宋长年等分离出枳的SPL9和SPL13基因，并认为其影响枳的茎和果实的发育[18]。以上的研究显示，植物SPL基因对果实生长发育有调控作用，SPL转录因子家族的不同成员可能调控果实发育成熟的不同生理代谢过程。近年来的一些报告显示，转录因子 SPL与浆果果实成熟有紧密联系，能调节和控制与果实成熟有关的基因。但直至今日，有关转录因子调控果实成熟的实验结果通常只能从番茄等模式植物中获得，在其他浆果类植物中，比如在葡萄中，鲜少有这方面的探索和成果。葡萄的基因组较小（约为500 Mbp），为拟南芥基因组大小的 3至4 倍左右，同时也是完成全基因测序的第四种开花植物，第二种木本植物。按照果实成熟的特征，果实能够分成呼吸跃变和非呼吸跃变两种基本类型，葡萄果实成熟属于典型的非呼吸跃变类型。既显著不同于拟南芥、水稻、玉米等果实，也不同于呼吸跃变型番茄果实的葡萄乃至其它果树方面尚无转录因子SPL调控果实发育成熟的分子机制的报道。因此，很有必要在非呼吸跃变型葡萄上开展相关研究。本实验对葡萄SPL9对果实生长发育的影响进行了研究。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法3
1.1 试验材料 3
1.2 葡萄果实RNA提取 3
1.3 mRNA的分离与纯化3
1.4 实时荧光定量PCR分析3
1.5 超表达载体构建及果实瞬时表达体系3
1.5.1 感受态细胞的制备——氯化钙法3
1.5.2 重组质粒的转化3
1.5.3 质粒的小量制备——碱裂解法制备4
1.5.4 感受态的制备4
1.5.5 转化农杆菌4
1.5.6 农杆菌侵染4
1.6 生物学信息分析5
2 结果与分析5
2.1 SPL9基因序列和蛋白质序列的特征5
2.2 不同物种的初步进化分析7
2.3 SPL9在果实发育过程中的表达趋势及意义8
2.4基因SPL9可能促进葡萄早熟8
3 讨论 9
致谢10
参考文献10
转录因子SPL9在葡萄果实发育过程中的功能分析
引言
葡萄是葡萄科葡萄属藤本植物，它本身营养丰富，人们对它有很高的赞誉。根据联合国粮食及 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
农业组织报道，葡萄栽培的面积始终在各类水果中保持第一，其生产量居各种水果的前几位。葡萄不仅是世界上四大水果之一，其栽培在我国历史十分悠久，中国也是一个大型的葡萄种植国家，根据新鲜葡萄产量的计算，中国已多年在世界上排名第一。除了可以作为新鲜水果来使用，而且可以用作酿造酒，制作果汁和葡萄干等加工食品的原料。葡萄具有较高营养，它含有很多矿物质元素、各种氨基酸和蛋白质等营养物质 [1]。调控葡萄果实成熟对葡萄的鲜食、保鲜贮藏和加工产品质量好坏都十分关键。近些年来，我国设施葡萄产业飞快发展，葡萄促成和延迟栽培技术应用越来越普遍。尽管这些栽培模式取得一定的收益，但促成或延迟成熟期后往往会伴随着葡萄果实品质的下降。产生这种情况的是有多种原因造成的，“对葡萄果实成熟的分子机理认识还不够充分，从而不能更科学地采取栽培措施调控葡萄果实发育成熟过程”可能是主要原因之一。
转录因子（Transcription factor, TF），也称反式作用因子，是一类可通过直接或间接与基因启动子区域中顺式作用元件发生特异性的相互作用，来调节基因表达的一类蛋白质分子[26]。至今，基本上在所有生物体中都检测到了转录因子的存在，且在许多生物的发育过程中都起着十分关键的作用。在植物中，也已经鉴定出了MYB、WRKY、bZIP等许多的转录因子家族。他们在调节植物的生长、分化、代谢以及对环境胁迫的应答方面扮演着不可或缺的角色。
SPL (SQUAMOSA promoter binding proteinlike)是一类植物特有的具有多功能的转录因子，广泛存在于绿色植物中，具有高度保守的DNA结合区域SBP结构域。在模式植物拟南芥里共发现17个SPL基因，水稻中有19个SPL基因[2]。初步网络和相互作用组分析表明，SPL基因通过调节其它转录因子发挥它们的功能，并且还可以参与葡萄糖，无机盐，和三磷酸腺苷（ATP）的产量的基础代谢过程[24]。越来越多的研究表明，SPL家族参与了植物的生长发育、代谢调节及非生物胁迫等多种生物过程，成为植物生长发育的调控枢纽[4]，在赤霉素响应、叶片发育、细胞凋亡、发育阶段转换、花和果实发育、光信号转导、育性、顶端优势、植物形态建设、间隔期长度、花青素积累、调控植物胚胎发育及体内铜离子稳态平衡等方面发挥重要作用[5]。许多SPL基因转录物上的miRNA响应元件（MRE）的存在预示着SPL基因与miRNA具有广泛相互作用，17个AtSPL中有11个被认为存在高度相似的miR156和miR157的识别位点[25]。具有或不具有miRNA的多种SPL功能和作用模式表现出植物生长和发育潜在的复杂的调控网络，当然，除了植物生长发育外也可能是其他过程，如应激反应和基础代谢[2]。在模式植物拟南芥中，拟南芥SPL蛋白的大小是不同的，范围从最少的131个氨基酸（AtSPL3）到927个氨基酸（AtSPL12）不等[6]。不同AtSPL基因在发育的不同阶段和不同组织部位单独或共同发挥各种作用，参与拟南芥花的发育[6] [7] [8]、调控GA合成[8]、营养生长和开花的转换[9]、叶片发生等[10]、叶片性状[13]、间隔期长度[12]等诸多发育过程。
果实发育成熟是一个复杂的过程，其中涉及到植物各组织各部分各种的生理和生化过程的分子调控。近来的研究发现SPL是调节和控制植物各个生长阶段的多种生物过程尤其是果实发育成熟的重要转录因子之一。拟南芥AtSPL10决定拟南芥的果荚的长度[13]。水稻OsSPL16可以影响水稻米粒大小、色泽、形状以及产量，提高OsSPL16的表达水平能促进增值胚乳细胞和充实籽粒，且增大粒宽、粒重和水稻产量。降低OsSPL16的表达水平则会使籽粒变得细长，增加胚乳的透明度，减小水稻的垩白率，让稻米外观品质更美观[14] [15]。玉米的籽粒稃壳发育也受玉米SPL基因的控制 [13] [41] [15] [19]。影响番茄成熟一个重要基因是番茄的 LeSPLCNR，该基因的启动子区发生表观变异时，会造成果皮类胡萝卜素的细胞壁结构与生物合成，从而延缓果实成熟[17]。宋长年等分离出枳的SPL9和SPL13基因，并认为其影响枳的茎和果实的发育[18]。以上的研究显示，植物SPL基因对果实生长发育有调控作用，SPL转录因子家族的不同成员可能调控果实发育成熟的不同生理代谢过程。近年来的一些报告显示，转录因子 SPL与浆果果实成熟有紧密联系，能调节和控制与果实成熟有关的基因。但直至今日，有关转录因子调控果实成熟的实验结果通常只能从番茄等模式植物中获得，在其他浆果类植物中，比如在葡萄中，鲜少有这方面的探索和成果。葡萄的基因组较小（约为500 Mbp），为拟南芥基因组大小的 3至4 倍左右，同时也是完成全基因测序的第四种开花植物，第二种木本植物。按照果实成熟的特征，果实能够分成呼吸跃变和非呼吸跃变两种基本类型，葡萄果实成熟属于典型的非呼吸跃变类型。既显著不同于拟南芥、水稻、玉米等果实，也不同于呼吸跃变型番茄果实的葡萄乃至其它果树方面尚无转录因子SPL调控果实发育成熟的分子机制的报道。因此，很有必要在非呼吸跃变型葡萄上开展相关研究。本实验对葡萄SPL9对果实生长发育的影响进行了研究。
版权保护: 本文由 hbsrm.com编辑，转载请保留链接: www.hbsrm.com/nongxue/yy/147.html
