ga4在解除果梅季节性休眠中的作用研究
摘要： 1摘要：为了分析外源GA4解除果梅花芽休眠的生理效应，以高需冷量果梅品种‘丰后’为试材，于果梅树体自然休眠期多次采集枝条，研究不同浓度GA4处理和质量分数为1% 的外源H2O2处理对人工气候室内水培枝条萌芽率和H2O2及抗氧化相关酶类活性的影响。结果表明200μM GA4处理的萌芽率明显高于质量分数为1% 的H2O2处理和对照，1% 的H2O2对休眠解除效果不明显；GA4处理的最佳浓度为200μM，最佳处理时期为元旦前后；在GA4处理促进果梅在休眠解除期间，其花芽内的H2O2和相关抗氧化酶发生规律性变化，其中，H2O2含量在果梅花芽在休眠解除时达到峰值，并且，促进H2O2产生的超氧化物歧化酶(SOD)活性也在此时达到峰值。过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）具有清除H2O2的作用，二者的活性分别在H2O2含量到达峰值之前和到达峰值之时受到抑制。基于对H2O2可能在休眠解除期间作为信号物质的认识，根据这些酶的含量变化推测GA4打破果梅花芽休眠可能通过抗氧化酶系统调控H2O2含量的变化来对休眠解除起作用。
目录
引言
休眠是落叶果树长期适应自然环境所形成的遗传特性，果树必需经过一定时期的低温,满足需冷量才能打破休眠。随着果树设施栽培的普及和发展，对安全高效的破眠剂
的需求越来越迫切。石灰氮、单氰胺[1]是目前打破休眠常用的试剂，但造成的毒害性较大。Rinne等[2]研究发现GA4能够打破休眠，促进杨树的花芽萌发。GA4毒性小，使用方便，但其使用浓度、时期和打破休眠的作用生理机制还未见报道。Prassinos等[3]认为休眠解除前H2O2的瞬间峰值可能作为一种分子信号激发休眠过渡期的芽解除休眠。Oracz等[4]在研究葵花种子休眠解除机制中发现活性氧可能作为HCN的第二信使，在解除休眠中起重要作用。许多研究显示，在休眠解除前，植物体内H2O2含量有一个显著的上升过程，推测H2O2可能作为信号物质在休眠解除中起重要作用[5]。
基于对H2O2在休眠解除中信号作用的认识，本研究在确定GA4的最佳使用浓度和时期的基础上试图通过休眠花芽内H2O2含量和抗氧化酶系统的变化来分析GA4解除花芽休眠的生理效应。
1 材料与方法
1.1 实验材料
实验材料取自南京傅
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
家边果梅园。试材为需冷量较高的9年生‘丰后’果梅品种。树势中庸、整齐一致，常规管理。
1.2 实验方法
1.2.1材料处理
2012年自11月30日起，每隔7d左右于田间采集芽体饱满充实、长度为20cm～40cm的一年生枝条，用湿布包裹枝条并迅速带回实验室。剪去枝条基部褐化的部分将枝条插入不同浓度的GA4溶液（浓度梯度见表1），每根枝条约40个花芽，每5根枝条为一个小区，重复三次，置于光照培养箱（型号：RXZ1000B）中培养，记录各个处理第10d的萌芽率。培养条件为：昼夜温度21±3°C，光/暗时数12/12h，光照强度55μmol m2 s1,空气相对湿度70%。每3d换一次溶液，并剪去枝条基部变褐的部分。判断萌芽的标准为花芽顶端开裂露绿。当枝条萌芽率达到50%，则认为枝条解除休眠[6]。2013年自12月21日起，每隔7d左右于田间采集芽体饱满充实、长度为20cm～40cm的一年生枝条，用湿布包裹枝条并迅速带回实验室。采回的枝条按长度分成条件一致的三份，剪去枝条基部褐化的部分，分别插入盛有200μM GA4、质量分数1% H2O2[7]和蒸馏水的玻璃瓶中进行水培，溶液淹没枝条基部3cm左右（每根枝条约40个花芽，每5根枝条作为一个小区，重复10次）并放入光照培养箱中。每个处理分别在光照培养箱中培养的第0、3、5、8、10天统计花芽萌芽率，并剥下一部分花芽贮存于20°C冰箱内备用。
1.2.2 生理指标测定
水培实验观察发现，GA4对于打破果梅花芽休眠的作用明显优于H2O2处理和蒸馏水对照。选择GA4处理效果最佳时期（水培10d后GA4处理萌芽率达50%，而其他两个处理萌芽率未达50%，即田间采样时间为2014年1月1日），测定该时期样品的H2O2含量与POD、SOD、CAT等的酶活。生理指标测定均使用分光光度计（型号：日本岛津UV2450）。过氧化氢含量以每克鲜重所含过氧化氢的毫摩尔数为单位[8]。过氧化氢酶活力测定采用紫外吸收法，以每分钟OD值减少0.1定义为一个酶活力单位；过氧化物酶活力测定采用愈创木酚法测，以每分钟470nm处OD值变化0.01为一个过氧化物酶活性单位；超氧化物歧化酶采用氮蓝四唑法，以抑制NBT光化还原的50%为一个酶活性单位 [9]。实验对磨样和称重步骤进行优化改进，所有指标均采用液氮磨样之后称重，以减少丙酮磨样造成样品称重方面的误差。
以H2O2含量测定为例简述对样品处理的改进。测定采用紫外分光光度计法：取10ml离心管、编号、加入5ml丙酮并称重放入4°C冰箱预冷备用；将研钵、研棒、药匙等放入液氮备用；取果梅花芽样品，用液氮研磨后将花芽粉末迅速转入盛有预冷丙酮的离心管并称重，混匀后用容量瓶定容至10ml；取5ml 3000rpm离心10min，取1ml上清加入5%的TiSO4和浓氨水，3000rpm离心10min、弃上清，洗沉淀三次，用5ml 2mol/L硫酸溶解沉淀，415nm处测吸光值；计算公式H2O2含量（μmol/g）=C ` Vt/W/Vs其中C为标准曲线上查得样品中H2O2浓度(μmol)，Vt样品提取液总体积(ml)，W植物组织鲜重(g)，Vs测定时所用的样品提取液的体积（ml）。
1.2.3 数据处理
数据统计采用SPSS 17.0进行单因素方差（OneWay ANOVA）分析，作图采用EXCEL2007。
2结果与分析
2.1 不同时期采用不同浓度GA4对‘丰后’果梅花芽的破眠效果
表1 ?不同时期采用不同浓度的GA4处理的‘丰后’果梅花芽的萌芽率
Table1 Percentage of dormancybroken buds of the flower buds of Japanese apricot cultivar “Bungo” using different concentration of GA4
GA4浓度（μM）
采样日期
2012.11.30
2012.12.15
2012.12.22
2012.12.31
2013.1.7
2013.1.14
2013.1.21
2013.2.1
0
0%
12%
20%
25%
29%
40%
48%
53%
50
0%
8%
32%
35%
39%
63%
80%
90%
100
0%
20%
36%
40%
50%
88%
85%
95%
200
3%
27%
40%
50%
目录
引言
休眠是落叶果树长期适应自然环境所形成的遗传特性，果树必需经过一定时期的低温,满足需冷量才能打破休眠。随着果树设施栽培的普及和发展，对安全高效的破眠剂
的需求越来越迫切。石灰氮、单氰胺[1]是目前打破休眠常用的试剂，但造成的毒害性较大。Rinne等[2]研究发现GA4能够打破休眠，促进杨树的花芽萌发。GA4毒性小，使用方便，但其使用浓度、时期和打破休眠的作用生理机制还未见报道。Prassinos等[3]认为休眠解除前H2O2的瞬间峰值可能作为一种分子信号激发休眠过渡期的芽解除休眠。Oracz等[4]在研究葵花种子休眠解除机制中发现活性氧可能作为HCN的第二信使，在解除休眠中起重要作用。许多研究显示，在休眠解除前，植物体内H2O2含量有一个显著的上升过程，推测H2O2可能作为信号物质在休眠解除中起重要作用[5]。
基于对H2O2在休眠解除中信号作用的认识，本研究在确定GA4的最佳使用浓度和时期的基础上试图通过休眠花芽内H2O2含量和抗氧化酶系统的变化来分析GA4解除花芽休眠的生理效应。
1 材料与方法
1.1 实验材料
实验材料取自南京傅
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
家边果梅园。试材为需冷量较高的9年生‘丰后’果梅品种。树势中庸、整齐一致，常规管理。
1.2 实验方法
1.2.1材料处理
2012年自11月30日起，每隔7d左右于田间采集芽体饱满充实、长度为20cm～40cm的一年生枝条，用湿布包裹枝条并迅速带回实验室。剪去枝条基部褐化的部分将枝条插入不同浓度的GA4溶液（浓度梯度见表1），每根枝条约40个花芽，每5根枝条为一个小区，重复三次，置于光照培养箱（型号：RXZ1000B）中培养，记录各个处理第10d的萌芽率。培养条件为：昼夜温度21±3°C，光/暗时数12/12h，光照强度55μmol m2 s1,空气相对湿度70%。每3d换一次溶液，并剪去枝条基部变褐的部分。判断萌芽的标准为花芽顶端开裂露绿。当枝条萌芽率达到50%，则认为枝条解除休眠[6]。2013年自12月21日起，每隔7d左右于田间采集芽体饱满充实、长度为20cm～40cm的一年生枝条，用湿布包裹枝条并迅速带回实验室。采回的枝条按长度分成条件一致的三份，剪去枝条基部褐化的部分，分别插入盛有200μM GA4、质量分数1% H2O2[7]和蒸馏水的玻璃瓶中进行水培，溶液淹没枝条基部3cm左右（每根枝条约40个花芽，每5根枝条作为一个小区，重复10次）并放入光照培养箱中。每个处理分别在光照培养箱中培养的第0、3、5、8、10天统计花芽萌芽率，并剥下一部分花芽贮存于20°C冰箱内备用。
1.2.2 生理指标测定
水培实验观察发现，GA4对于打破果梅花芽休眠的作用明显优于H2O2处理和蒸馏水对照。选择GA4处理效果最佳时期（水培10d后GA4处理萌芽率达50%，而其他两个处理萌芽率未达50%，即田间采样时间为2014年1月1日），测定该时期样品的H2O2含量与POD、SOD、CAT等的酶活。生理指标测定均使用分光光度计（型号：日本岛津UV2450）。过氧化氢含量以每克鲜重所含过氧化氢的毫摩尔数为单位[8]。过氧化氢酶活力测定采用紫外吸收法，以每分钟OD值减少0.1定义为一个酶活力单位；过氧化物酶活力测定采用愈创木酚法测，以每分钟470nm处OD值变化0.01为一个过氧化物酶活性单位；超氧化物歧化酶采用氮蓝四唑法，以抑制NBT光化还原的50%为一个酶活性单位 [9]。实验对磨样和称重步骤进行优化改进，所有指标均采用液氮磨样之后称重，以减少丙酮磨样造成样品称重方面的误差。
以H2O2含量测定为例简述对样品处理的改进。测定采用紫外分光光度计法：取10ml离心管、编号、加入5ml丙酮并称重放入4°C冰箱预冷备用；将研钵、研棒、药匙等放入液氮备用；取果梅花芽样品，用液氮研磨后将花芽粉末迅速转入盛有预冷丙酮的离心管并称重，混匀后用容量瓶定容至10ml；取5ml 3000rpm离心10min，取1ml上清加入5%的TiSO4和浓氨水，3000rpm离心10min、弃上清，洗沉淀三次，用5ml 2mol/L硫酸溶解沉淀，415nm处测吸光值；计算公式H2O2含量（μmol/g）=C ` Vt/W/Vs其中C为标准曲线上查得样品中H2O2浓度(μmol)，Vt样品提取液总体积(ml)，W植物组织鲜重(g)，Vs测定时所用的样品提取液的体积（ml）。
1.2.3 数据处理
数据统计采用SPSS 17.0进行单因素方差（OneWay ANOVA）分析，作图采用EXCEL2007。
2结果与分析
2.1 不同时期采用不同浓度GA4对‘丰后’果梅花芽的破眠效果
表1 ?不同时期采用不同浓度的GA4处理的‘丰后’果梅花芽的萌芽率
Table1 Percentage of dormancybroken buds of the flower buds of Japanese apricot cultivar “Bungo” using different concentration of GA4
GA4浓度（μM）
采样日期
2012.11.30
2012.12.15
2012.12.22
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