葡萄和桃果实糖代谢重要差异基因的识别及表达分析
摘要：为了对葡萄（Vitis vinifera L.)和桃(Amygdalus persica L.）果实发育过程中糖代谢途径有进一步的认识，本实验以拟南芥糖代谢途径关键酶的调控基因为探针，分别对葡萄和桃基因组进行BLAST比对，获得了葡萄和桃果实发育过程中糖代谢途径中的关键酶的调控基因，并发现许多酶是由多基因编码的；再将检索得到的糖代谢关键酶磷酸葡萄糖变位酶(Phosphoglucomutase, PGM)和淀粉分支酶(Starch Branching Enzyme，SBE)的编码基因分别在葡萄和桃EST数据库中进行检索，发现PGM和SBE的编码基因均在葡萄和桃的果实中大量表达；运用半定量PCR技术依次对发育阶段的葡萄和桃果实中的PGM和SBE编码基因进行表达分析，结果表明，PGM和SBE的编码基因在发育阶段的葡萄和桃果实中的表达水平和表达模式均不同，并且二者的多个编码基因在桃果实中表达水平更高。
目录
摘 要 3
关键词 3
Abstract 3
Key words 3
前言 4
1 研究材料 4
2 实验方法 5
2.1 葡萄和桃果实的糖代谢途径中关键酶 5
2.2 引物设计 5
2.3 生物信息学分析 6
2.4 糖代谢途径中关键酶基因的半定量表达 6
2.4.1 葡萄果实、桃果实总RNA的提取 6
2.4.2 总RNA中DNA的消化 7
2.4.3 cDNA第一链的合成与质量检测 7
2.4.4 半定量PCR 8
3 结果与分析 8
3.1 葡萄和桃果实糖代谢途径中关键酶编码基因的识别 8
3.1.1 葡萄和桃糖代谢途径关键酶基因的检索整理 8
3.1.2 PGM和SBE编码基因在葡萄和桃EST数据库中的生物信息学分析 10
3.2 糖代谢途径关键酶基因的半定量表达分析 14
3.2.1 葡萄、桃果实总RNA的提取及消化 14
3.2.2 cDNA质量检测 15
3.2.3 PGM和SBE基因半定量PCR结果 16
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
4 讨论 17
致谢 18
参考文献 19
葡萄和桃果实糖代谢重要差异基因的识别及表达分析
引言
前言：葡萄（Vitis vinifera L.）和桃（Amygdalus persica L.）均是世界性重要果树。葡萄和桃作为世界上重要的鲜食果品和加工原料，其糖分积累的过程却略有差异。葡萄生长发育早期有极少量淀粉积累，其余均以可溶性糖的形式输入果实并贮藏于液泡中，主要是以积累己糖为主（张上隆 等, 2007）；桃在发育早中期将输入的光合产物转化为淀粉进行积累，至果实发育后期一方面光合产物以糖的形式直接输入，同时，淀粉开始水解转入糖代谢，从而使果实糖含量上升（陈昆松 等, 2007）。糖分积累的过程是果实发育与品质形成的关键（王晨 等, 2009; Teixeira 等, 2005）。因此，有关葡萄和桃中糖代谢途径的研究一直是国内外果树研究领域的一个热点和重点（Davise C 等, 1996; Hayes M A 等, 2010）。植物的任何代谢本质上都是由相关基因控制的，果实中糖代谢的遗传机理也是由许多基因相互作用、共同调控产生的结果。其中葡萄糖磷酸变位酶（Phosphoglucomutase, PGM）催化G1P ?G6P的可逆反应。G6P可以进入戊糖磷酸途径被代谢，也可以转变为G1P用于合成淀粉或蔗糖，因此它是决定碳水化合物用于淀粉合成还是用于蔗糖合成的一个关键酶。淀粉分支酶（Starch Branching Enzyme, SBE）是一种葡萄糖基转移酶，它首先催化内部α1,4葡萄糖苷键水解，继而将断链（含有原来的非还原端）连接到C6羟基上形成α1,6分支点。糖生物合成与降解途径中的编码关键酶基因的克隆及表达分析已经在许多植物如，拟南芥、苹果和葡萄（Davies 等, 1999; Fillion 等, 1999; Kanayama 等, 1992; Karve 等, 2012; Manning 等, 2001; Vargas 等, 2008; Yamada 等, 1998; Zheng 等, 2011）上进行了报道，而PGM和SBE这两种酶的调控基因在葡萄和桃上的克隆及表达分析的报道较少。
随着分子生物学的日益发展，以及生物信息学的资源积累，从基因本质上研究研究植物生长代谢过程的机理成为现今研究的主流。以往的化学分析的方法只能从现象上解释其糖类代谢的过程，而无法从根本上解释其代谢的根本原因，也就无法从基因角度上改变糖类成分的种类及含量的多少，从而提高产量并改善品质。因此本研究论文以文献报道中不同果实中可溶性糖含量的不同为切入点，以模式植物拟南芥（TAIR: http://www.arabidopsis.org/index.jsp）中糖代谢关键酶调控基因的cDNA序列全长为探针，对葡萄和桃基因组数据库进行BLAST比对，获得与拟南芥序列同源性高的葡萄和桃糖代谢关键酶的调控基因，并对这些基因进行表达分析研究，进一步从分子水平上认识葡萄和桃果实糖代谢机理的差异，为今后利用分子手段提高葡萄和桃果实品质提供理论依据。
研究材料
试材以种植于江苏省大学园艺学院江浦试验站研究基地适应性强、果粒大小均匀、糖分含量高的葡萄品种“藤稔”作为实验试材，于2013年5月中旬8月末分阶段采集果实；以种植于江苏省农业科学院果树种质圃内适应性强、果实大小均匀、糖分含量高的桃品种“大久保”作为实验试材，于2013年5月8月末分阶段采集果实。
葡萄分别采摘于幼果期（5月19日）、停滞期（6月19日）、转熟期（7月19日）和成熟期（8月19日）；桃分别采摘于幼果期（5月8日）、果实开始着色期（6月10日）、果实转色期（7月12日）和成熟期（8月14日）。
采样当天进行及时处理，当天将采摘好的葡萄选几粒切半用锡箔纸包好，未切的也用锡箔纸包好；桃挑几个切成等份，选几份用锡箔纸包好，其余的也用锡箔纸包好。分别用液氮迅速冷冻，于40℃保存备用。
实验方法
2.1 葡萄和桃果实糖代谢途径中的关键酶
综合整理代谢途径，查找、总结糖代谢途径中的关键酶。
图1 糖代谢基本途径图
注：Sucrose：蔗糖； spp：磷酸蔗糖酶； S6P：蔗糖6磷酸； sps：蔗糖磷酸合成酶； UDPG:尿苷二磷酸葡萄糖（uridine diphosphate glucose,UDPG）； UGP：尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶； g1p：葡萄糖1磷酸； PGM：葡萄糖磷酸变位酶； G6P：葡萄糖6磷酸； F6P：果糖6磷酸； FBP；果糖1,6二磷酸； Tp：三磷酸； S6PDH：6磷酸山梨醇脱氢酶； Sor6p：6磷酸山梨醇； Sorpp：6磷酸山梨醇磷酸酶； Sorbitol：山梨醇； Glucose：葡萄糖； Fructose：果糖； Sucrose：蔗糖； starch：淀粉； ADPG：腺苷二磷酸葡萄糖； a:蔗糖水解生成葡萄糖和果糖； b:蔗糖生成果糖和葡萄糖； c:果糖和尿苷二磷酸葡萄糖生成蔗糖； d:山梨醇生成葡萄糖； e:山梨醇生成葡萄糖； f:山梨醇生成果糖； g:葡萄糖生成6磷酸葡萄糖； h:6磷酸葡萄糖生成6磷酸果糖； i:果糖生成6磷酸果糖； j:尿苷二磷酸葡萄糖生成1磷酸葡萄糖； k:1磷酸葡萄糖生成6磷酸葡萄糖； l:1磷酸葡萄糖生成腺苷二磷酸葡萄糖； m:6磷酸果糖生成6磷酸山梨醇； n:6磷酸山梨醇生成蔗糖； o:蔗糖生成葡萄糖和果糖(在液泡中进行)； p:腺苷二磷酸葡萄糖生成淀粉（k、l、p三步为淀粉生成过程，在淀粉体中进行）
目录
摘 要 3
关键词 3
Abstract 3
Key words 3
前言 4
1 研究材料 4
2 实验方法 5
2.1 葡萄和桃果实的糖代谢途径中关键酶 5
2.2 引物设计 5
2.3 生物信息学分析 6
2.4 糖代谢途径中关键酶基因的半定量表达 6
2.4.1 葡萄果实、桃果实总RNA的提取 6
2.4.2 总RNA中DNA的消化 7
2.4.3 cDNA第一链的合成与质量检测 7
2.4.4 半定量PCR 8
3 结果与分析 8
3.1 葡萄和桃果实糖代谢途径中关键酶编码基因的识别 8
3.1.1 葡萄和桃糖代谢途径关键酶基因的检索整理 8
3.1.2 PGM和SBE编码基因在葡萄和桃EST数据库中的生物信息学分析 10
3.2 糖代谢途径关键酶基因的半定量表达分析 14
3.2.1 葡萄、桃果实总RNA的提取及消化 14
3.2.2 cDNA质量检测 15
3.2.3 PGM和SBE基因半定量PCR结果 16
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
4 讨论 17
致谢 18
参考文献 19
葡萄和桃果实糖代谢重要差异基因的识别及表达分析
引言
前言：葡萄（Vitis vinifera L.）和桃（Amygdalus persica L.）均是世界性重要果树。葡萄和桃作为世界上重要的鲜食果品和加工原料，其糖分积累的过程却略有差异。葡萄生长发育早期有极少量淀粉积累，其余均以可溶性糖的形式输入果实并贮藏于液泡中，主要是以积累己糖为主（张上隆 等, 2007）；桃在发育早中期将输入的光合产物转化为淀粉进行积累，至果实发育后期一方面光合产物以糖的形式直接输入，同时，淀粉开始水解转入糖代谢，从而使果实糖含量上升（陈昆松 等, 2007）。糖分积累的过程是果实发育与品质形成的关键（王晨 等, 2009; Teixeira 等, 2005）。因此，有关葡萄和桃中糖代谢途径的研究一直是国内外果树研究领域的一个热点和重点（Davise C 等, 1996; Hayes M A 等, 2010）。植物的任何代谢本质上都是由相关基因控制的，果实中糖代谢的遗传机理也是由许多基因相互作用、共同调控产生的结果。其中葡萄糖磷酸变位酶（Phosphoglucomutase, PGM）催化G1P ?G6P的可逆反应。G6P可以进入戊糖磷酸途径被代谢，也可以转变为G1P用于合成淀粉或蔗糖，因此它是决定碳水化合物用于淀粉合成还是用于蔗糖合成的一个关键酶。淀粉分支酶（Starch Branching Enzyme, SBE）是一种葡萄糖基转移酶，它首先催化内部α1,4葡萄糖苷键水解，继而将断链（含有原来的非还原端）连接到C6羟基上形成α1,6分支点。糖生物合成与降解途径中的编码关键酶基因的克隆及表达分析已经在许多植物如，拟南芥、苹果和葡萄（Davies 等, 1999; Fillion 等, 1999; Kanayama 等, 1992; Karve 等, 2012; Manning 等, 2001; Vargas 等, 2008; Yamada 等, 1998; Zheng 等, 2011）上进行了报道，而PGM和SBE这两种酶的调控基因在葡萄和桃上的克隆及表达分析的报道较少。
随着分子生物学的日益发展，以及生物信息学的资源积累，从基因本质上研究研究植物生长代谢过程的机理成为现今研究的主流。以往的化学分析的方法只能从现象上解释其糖类代谢的过程，而无法从根本上解释其代谢的根本原因，也就无法从基因角度上改变糖类成分的种类及含量的多少，从而提高产量并改善品质。因此本研究论文以文献报道中不同果实中可溶性糖含量的不同为切入点，以模式植物拟南芥（TAIR: http://www.arabidopsis.org/index.jsp）中糖代谢关键酶调控基因的cDNA序列全长为探针，对葡萄和桃基因组数据库进行BLAST比对，获得与拟南芥序列同源性高的葡萄和桃糖代谢关键酶的调控基因，并对这些基因进行表达分析研究，进一步从分子水平上认识葡萄和桃果实糖代谢机理的差异，为今后利用分子手段提高葡萄和桃果实品质提供理论依据。
研究材料
试材以种植于江苏省大学园艺学院江浦试验站研究基地适应性强、果粒大小均匀、糖分含量高的葡萄品种“藤稔”作为实验试材，于2013年5月中旬8月末分阶段采集果实；以种植于江苏省农业科学院果树种质圃内适应性强、果实大小均匀、糖分含量高的桃品种“大久保”作为实验试材，于2013年5月8月末分阶段采集果实。
葡萄分别采摘于幼果期（5月19日）、停滞期（6月19日）、转熟期（7月19日）和成熟期（8月19日）；桃分别采摘于幼果期（5月8日）、果实开始着色期（6月10日）、果实转色期（7月12日）和成熟期（8月14日）。
采样当天进行及时处理，当天将采摘好的葡萄选几粒切半用锡箔纸包好，未切的也用锡箔纸包好；桃挑几个切成等份，选几份用锡箔纸包好，其余的也用锡箔纸包好。分别用液氮迅速冷冻，于40℃保存备用。
实验方法
2.1 葡萄和桃果实糖代谢途径中的关键酶
综合整理代谢途径，查找、总结糖代谢途径中的关键酶。
图1 糖代谢基本途径图
注：Sucrose：蔗糖； spp：磷酸蔗糖酶； S6P：蔗糖6磷酸； sps：蔗糖磷酸合成酶； UDPG:尿苷二磷酸葡萄糖（uridine diphosphate glucose,UDPG）； UGP：尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶； g1p：葡萄糖1磷酸； PGM：葡萄糖磷酸变位酶； G6P：葡萄糖6磷酸； F6P：果糖6磷酸； FBP；果糖1,6二磷酸； Tp：三磷酸； S6PDH：6磷酸山梨醇脱氢酶； Sor6p：6磷酸山梨醇； Sorpp：6磷酸山梨醇磷酸酶； Sorbitol：山梨醇； Glucose：葡萄糖； Fructose：果糖； Sucrose：蔗糖； starch：淀粉； ADPG：腺苷二磷酸葡萄糖； a:蔗糖水解生成葡萄糖和果糖； b:蔗糖生成果糖和葡萄糖； c:果糖和尿苷二磷酸葡萄糖生成蔗糖； d:山梨醇生成葡萄糖； e:山梨醇生成葡萄糖； f:山梨醇生成果糖； g:葡萄糖生成6磷酸葡萄糖； h:6磷酸葡萄糖生成6磷酸果糖； i:果糖生成6磷酸果糖； j:尿苷二磷酸葡萄糖生成1磷酸葡萄糖； k:1磷酸葡萄糖生成6磷酸葡萄糖； l:1磷酸葡萄糖生成腺苷二磷酸葡萄糖； m:6磷酸果糖生成6磷酸山梨醇； n:6磷酸山梨醇生成蔗糖； o:蔗糖生成葡萄糖和果糖(在液泡中进行)； p:腺苷二磷酸葡萄糖生成淀粉（k、l、p三步为淀粉生成过程，在淀粉体中进行）
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