梨全基因组的慢速阴离子通道家族分析
摘要：慢速阴离子通道（Slow-type Anion Channel；SLAC）基因家族是广泛存在真核细胞中的多基因家族，在高等植物细胞的生命活动中起重要的作用。SLAC蛋白参与了植物的生理调节、生长发育和信号转导等诸多反应。目前SLAC基因家族已经在拟南芥等模式植物进行了生物信息学分析，但对于木本植物SLAC基因家族的研究甚少。本文主要分析了梨SLAC基因家族，通过对SLAC基因家族的基因结构、染色体分布、系统进化及梨SLAC基因家族在梨根系中对于阴离子（硝酸根离子）响应的实时荧光表达量分析，为在木本植物梨上开展慢速阴离子通道的相关研究提供基础。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法3
1.1 植物材料3
1.2获取拟南芥SLAC家族基因3
1.3收集不同物种的同源基因3
1.4染色体定位3
1.5预测SLAC同源基因蛋白理化性质3
1.6绘制基因结构图3
1.7 MEME分析4
1.8 构建系统进化树4
1.9 SLAC基因表达分析4
1.9.1 植物材料的获得4
1.9.2 提取梨根系RNA4
1.9.3 实时荧光定量qPCR检测SLAC基因在硝酸根离子诱导下表达量的变化4
2 结果与分析5
2.1 SLAC/SLAH家族成员的基因结构5
2.2 拟南芥SLAC/SLAH家族和梨SLAC家族成员确定及其染色体分布8
2.3 SLAC/SLAH家族进化分析8
2.4 梨SLAC家族基因表达分析9
3 讨论9
致谢10
参考文献10
基于梨全基因组的慢速阴离子通道家族分析
引言
梨是我国第三大水果，全世界约有76个国家及地区栽培。梨的主要栽培品种可分为东方梨(又称亚洲梨)和西洋梨两大类[1]。东方梨主要产于中国、日本、韩国等亚洲国家，包括砂梨( Pyrus pyrifolia Nakai)、白梨( Py
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
rus bretschneideri Rehd. )和秋子梨(Pyrus ussuriensis Maxim. )等[1]。欧洲、美洲、非洲和大洋州为西洋梨的主要产区，美国、意大利、西班牙、阿根廷等国家为西洋梨主产国。我国梨的生产区域很广，除海南省及港澳地区外，全国均有规模化栽培。梨作为我国的优势果品之一，不管对于丰富水果市场结构、满足消费者需求，还是农民增收、农业发展来说，梨果均占有举足轻重的地位。然而，中国作为产梨大国，并非产梨强国，栽培面积和产量虽居世界之首，但生产水平与发达国家相比相差甚远[1]。
随着测序技术的不断发展，已经开始在更多物种更多个体上进行全基因组测序，通过全基因组测序，得到了包括全基因组序列，转录组及表达数据，蛋白质组和代谢组数据，基因型和表型数据，遗传图谱与物理图谱在内的大量生物学信息。自2007年葡萄（Vitis vinifera）基因组测序完成以来，先后有10种果树的全基因组测序工作已经完成[2]，其中梨全基因组测序于2012年完成[3]。果树全基因组测序的完成有望实现利用基因组技术，突破传统分子生物学相关研究的的技术瓶颈，实现高通量分析。根据所获得的全基因组序列，结合分子生物学生物信息学以及生物工程等研究手段，阐明关键基因的功能，进一步解析重要农艺性状提供良好的研究平台，为培育优质、抗病的果树新品种和栽培管理技术奠定坚实基础，推动果树科学研究和生产实践的快速发展[2]。
离子通道是一类控制离子进出细胞的膜镶嵌蛋白，它们跨过细胞膜系统的磷脂双分子层，允许适当大小和适当电荷带电离子通过。根据其调控特性，离子通道主要分为4种，分别为配体门控离子通道（ligandgated ion channels），电压门控离子通道(voltagegated ion channels)，牵张门控离子通道(stretchgated ion channels )和光控离子通道(lightgated ion channels)等。离子选择性、通透性、电流特性、单通道电导特性及门控特性等决定了离子通道的特异性。在生命发育以及生理变化过程中，离子通道的活性以及开关状态受到多种细胞因子的调节，因此在诱导细胞专一性反应等方面被广泛深入研究。自从20世纪70年代膜片钳技术发明并广泛应用以来，人们对离子通道的理解越来越深入。阴离子通道是植物一种重要的离子通道，它们在对植物生长发育的调节、对营养物质的吸收及对逆境(干旱、高盐、缺磷和铝毒胁迫)的适应中起着至关重要的作用。目前的研究表明，阴离子通道可分为两种，分别被称为R型( Rapidtype )和S型(Slowtype)阴离子通道[4]，即快速阴离子通道和慢速阴离子通道。阴离子通道在植物各个组织和器官中广泛存在，在不同的生理环境中被激活或抑制，从而调控不同的生理过程。这些各异的器官分布、生理功能及对不同生理过程的响应，导致阴离子通道的调控方式、分子生物学基础也不近相同[5]。一般来说，由于细胞质内阴离子的浓度，大多数阴离子的平衡电位都偏正或者些微偏负[5]。胞外渗透压的上升或Al3+浓度的增加及胞内Ca2+浓度的增加，都可能激活阴离子通道。在保卫细胞中，Ca2+、核苷酸和脱落酸（ABA）以及生长素的浓度变化，都对阴离子通道的开放和关闭具有十分重要的调节作用[6]。
慢速阴离子通道(slowtype anion channels；SLAC)的开关，保卫细胞的渗透压发生了改变，从而对气孔开放和关闭有一定的调节作用[7]。SLAC1定位于气孔保卫细胞质膜上，介导阴离子流出，从而调节气孔的开关状态。SLAC1阴离子外向型通道可以被一个信号分子激活，目前认为这个信号分子是脱落酸(ABA)诱导气孔关闭信号通路的主要元件，此外，也有研究表明这个信号分子还介入响应了气孔关闭的其他信号路径。同时研究表明，通过下调K+通道的活性，SLAC1功能缺失突变体的表型将发生补偿，导致气孔打开速度减慢[8]。
通过在烟草BY2细胞中过表达拟南芥SLAC1[9]， SLAC1过表达增加了隐地蛋白cryptogein诱导的Cl外流，导致细胞外pH值增加，NADPH氧化酶活性上升，活性氧（ROS）的浓度增高[10]，从而增强了隐地蛋白cryptogein诱导BY2过敏性细胞死亡的敏感性。这些发现说明 SLAC/SLAH基因家族在植物防御信号转导网络中触发了质膜上的离子通道，对阴离子的流出起到了重要作用。SLAC1分子生物学的和电生理学的研究发现，SLAC1在保卫细胞的质膜上对Cl的通透性大于对苹果酸的通透性，表明SLAC1是位于质膜上的Slowtype阴离子通道，SLAC1参与气孔关闭早期的调控，被ABA，O3，CO2等物质所激活。SLAC1的四个直系同源SLAH14，也在拟南芥中被鉴定出来，与SLAC1一起组成了SLAC/SLAH家族[11]。早期认为SLAC1是氯离子和苹果酸的外流通道，后来证明SLAC1可以高效通过NO3[12]。另一个质膜Slowtype阴离子通道SLAH3（SLAC1 Homologue3），对NO3的渗透性比Cl高大约20倍，同时发现细胞外NO3可以显著激活SLAH3[13]。因此认为，SLAC1和SLAH3对NO3的运输起了重要的作用[11]。
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摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法3
1.1 植物材料3
1.2获取拟南芥SLAC家族基因3
1.3收集不同物种的同源基因3
1.4染色体定位3
1.5预测SLAC同源基因蛋白理化性质3
1.6绘制基因结构图3
1.7 MEME分析4
1.8 构建系统进化树4
1.9 SLAC基因表达分析4
1.9.1 植物材料的获得4
1.9.2 提取梨根系RNA4
1.9.3 实时荧光定量qPCR检测SLAC基因在硝酸根离子诱导下表达量的变化4
2 结果与分析5
2.1 SLAC/SLAH家族成员的基因结构5
2.2 拟南芥SLAC/SLAH家族和梨SLAC家族成员确定及其染色体分布8
2.3 SLAC/SLAH家族进化分析8
2.4 梨SLAC家族基因表达分析9
3 讨论9
致谢10
参考文献10
基于梨全基因组的慢速阴离子通道家族分析
引言
梨是我国第三大水果，全世界约有76个国家及地区栽培。梨的主要栽培品种可分为东方梨(又称亚洲梨)和西洋梨两大类[1]。东方梨主要产于中国、日本、韩国等亚洲国家，包括砂梨( Pyrus pyrifolia Nakai)、白梨( Py
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
rus bretschneideri Rehd. )和秋子梨(Pyrus ussuriensis Maxim. )等[1]。欧洲、美洲、非洲和大洋州为西洋梨的主要产区，美国、意大利、西班牙、阿根廷等国家为西洋梨主产国。我国梨的生产区域很广，除海南省及港澳地区外，全国均有规模化栽培。梨作为我国的优势果品之一，不管对于丰富水果市场结构、满足消费者需求，还是农民增收、农业发展来说，梨果均占有举足轻重的地位。然而，中国作为产梨大国，并非产梨强国，栽培面积和产量虽居世界之首，但生产水平与发达国家相比相差甚远[1]。
随着测序技术的不断发展，已经开始在更多物种更多个体上进行全基因组测序，通过全基因组测序，得到了包括全基因组序列，转录组及表达数据，蛋白质组和代谢组数据，基因型和表型数据，遗传图谱与物理图谱在内的大量生物学信息。自2007年葡萄（Vitis vinifera）基因组测序完成以来，先后有10种果树的全基因组测序工作已经完成[2]，其中梨全基因组测序于2012年完成[3]。果树全基因组测序的完成有望实现利用基因组技术，突破传统分子生物学相关研究的的技术瓶颈，实现高通量分析。根据所获得的全基因组序列，结合分子生物学生物信息学以及生物工程等研究手段，阐明关键基因的功能，进一步解析重要农艺性状提供良好的研究平台，为培育优质、抗病的果树新品种和栽培管理技术奠定坚实基础，推动果树科学研究和生产实践的快速发展[2]。
离子通道是一类控制离子进出细胞的膜镶嵌蛋白，它们跨过细胞膜系统的磷脂双分子层，允许适当大小和适当电荷带电离子通过。根据其调控特性，离子通道主要分为4种，分别为配体门控离子通道（ligandgated ion channels），电压门控离子通道(voltagegated ion channels)，牵张门控离子通道(stretchgated ion channels )和光控离子通道(lightgated ion channels)等。离子选择性、通透性、电流特性、单通道电导特性及门控特性等决定了离子通道的特异性。在生命发育以及生理变化过程中，离子通道的活性以及开关状态受到多种细胞因子的调节，因此在诱导细胞专一性反应等方面被广泛深入研究。自从20世纪70年代膜片钳技术发明并广泛应用以来，人们对离子通道的理解越来越深入。阴离子通道是植物一种重要的离子通道，它们在对植物生长发育的调节、对营养物质的吸收及对逆境(干旱、高盐、缺磷和铝毒胁迫)的适应中起着至关重要的作用。目前的研究表明，阴离子通道可分为两种，分别被称为R型( Rapidtype )和S型(Slowtype)阴离子通道[4]，即快速阴离子通道和慢速阴离子通道。阴离子通道在植物各个组织和器官中广泛存在，在不同的生理环境中被激活或抑制，从而调控不同的生理过程。这些各异的器官分布、生理功能及对不同生理过程的响应，导致阴离子通道的调控方式、分子生物学基础也不近相同[5]。一般来说，由于细胞质内阴离子的浓度，大多数阴离子的平衡电位都偏正或者些微偏负[5]。胞外渗透压的上升或Al3+浓度的增加及胞内Ca2+浓度的增加，都可能激活阴离子通道。在保卫细胞中，Ca2+、核苷酸和脱落酸（ABA）以及生长素的浓度变化，都对阴离子通道的开放和关闭具有十分重要的调节作用[6]。
慢速阴离子通道(slowtype anion channels；SLAC)的开关，保卫细胞的渗透压发生了改变，从而对气孔开放和关闭有一定的调节作用[7]。SLAC1定位于气孔保卫细胞质膜上，介导阴离子流出，从而调节气孔的开关状态。SLAC1阴离子外向型通道可以被一个信号分子激活，目前认为这个信号分子是脱落酸(ABA)诱导气孔关闭信号通路的主要元件，此外，也有研究表明这个信号分子还介入响应了气孔关闭的其他信号路径。同时研究表明，通过下调K+通道的活性，SLAC1功能缺失突变体的表型将发生补偿，导致气孔打开速度减慢[8]。
通过在烟草BY2细胞中过表达拟南芥SLAC1[9]， SLAC1过表达增加了隐地蛋白cryptogein诱导的Cl外流，导致细胞外pH值增加，NADPH氧化酶活性上升，活性氧（ROS）的浓度增高[10]，从而增强了隐地蛋白cryptogein诱导BY2过敏性细胞死亡的敏感性。这些发现说明 SLAC/SLAH基因家族在植物防御信号转导网络中触发了质膜上的离子通道，对阴离子的流出起到了重要作用。SLAC1分子生物学的和电生理学的研究发现，SLAC1在保卫细胞的质膜上对Cl的通透性大于对苹果酸的通透性，表明SLAC1是位于质膜上的Slowtype阴离子通道，SLAC1参与气孔关闭早期的调控，被ABA，O3，CO2等物质所激活。SLAC1的四个直系同源SLAH14，也在拟南芥中被鉴定出来，与SLAC1一起组成了SLAC/SLAH家族[11]。早期认为SLAC1是氯离子和苹果酸的外流通道，后来证明SLAC1可以高效通过NO3[12]。另一个质膜Slowtype阴离子通道SLAH3（SLAC1 Homologue3），对NO3的渗透性比Cl高大约20倍，同时发现细胞外NO3可以显著激活SLAH3[13]。因此认为，SLAC1和SLAH3对NO3的运输起了重要的作用[11]。
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