梨pfk基因家族生物信息学及表达分析
摘要：[目的] 磷酸果糖激酶（PFK）是糖酵解途径中的关键酶，但是对梨PFK基因家族还没有系统的研究。所以对其在梨中进行相关分子生物学研究，以揭示PFK基因家族的进化和表达，拥有重要意义。[方法] 本项目通过生物信息学的手段，利用数据库和生物信息学软件，对梨PFK基因家族进行了系统的分析。[结果] 通过该项目我们发现：梨中一共有14条PFK基因，这14条基因可以被分成5个亚族。PFK是一个古老的基因，出现在拟南芥和蔷薇科物种分化之前。对其结构和保守域的分析证明PFK是一个不保守的基因。全基因复制和散布复制是PFK基因家族在进化中的主要方式。最后，表达分析显示基因Pbr028609.1、Pbr000007.1、Pbr015118.1很少在任何果实时期表达，很可能是因为缺失了重要的基因结构。[结论] 通过生物信息学和表达分析，我们获得PFK基因家族基因的进化、结构、复制、表达等信息，为今后的研究奠定基础。
目录
摘要2
关键词2
Abstract2
Key words2
引言2
1 材料与方法3
1.1 材料 3
1.1.1 植物材料3
1.1.2 引物3
1.1.3 相关试剂和仪器4
1.2 方法 4
1.2.1 PFK基因家族的搜索和筛选4
1.2.2 PFK基因家族的序列比对分析与进化树分析4
1.2.3 PFK基因家族的外显子内含子结构分析及MEME 蛋白基序分析 4
1.2.4 PFK基因染色体定位、共线性分析和复制事件4
1.2.5 PFK基因同义突变率分析5
1.2.6 梨PFK基因果实发育转录组分析5
1.2.7 RNA提取及反转录5
1.2.8 半定量PCR表达分析5
2 结果与分析5
2．1梨PFK基因家族的生物信息学分析5
2.1.1 PFK基因家族基因确定 5
2.1.2 PFK基因家族进化树和家族分类6
2.1.3染色体定位及共线性分析8
2.1.4基因结构分析9
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
/> 2.1.5 PFK基因家族复制方式及同义突变分析10
2．2 PFK基因家族表达分析10
2.2.1果实发育时期PFK基因表达11
2.2.2组织特异性表达分析 11
3 讨论 12
3．1 PFK基因家族的进化分析 12
3．2 PFK基因家族基因的结构分析 12
3．3 PFK基因家族的复制模式 13
3．4 PFK基因家族的表达分析 13
参考文献 14
致谢15
梨PFK基因家族生物信息学及表达分析
引言
引言
梨是我国最重要的经济作物之一，梨果鲜美,肉脆多汁,酸甜可口,风味芳香优美。富含糖、蛋白质、脂肪、碳水化合物及多种维生素,对人体健康有重要作用。我国是梨属植物中心发源地之一,梨品质的提高对我国经济发展有重要的意义。而对果实的品质的改善提高经济效益的重要手段，果实的含糖量是果实品质的重要因素，对影响糖分因素的研究有重要的意义。近年来，白梨（Pyrus bretschneideri Rehd.）与西洋梨（P. communis L.）相继完成基因组测序和序列释放[1,2]，为在全基因组水平上研究梨重要功能的基因提供了基础数据。
糖酵解途径所有有机体中重要的新陈代谢途径，在园艺作物中，糖酵解作为除蔗糖山梨醇之外的碳水化合物的主要代谢途径，对植物的新陈代谢和糖分的积累有重要的影响。磷酸果糖激酶是糖酵解途径中的主要限速梅，并可以调节糖酸含量之间的平衡[4][14]。在已有的研究中，以及对小麦、发芽的黄瓜种子和蓖麻中的PFK进行了特性鉴定[5,6,7]。这些研究推测，在植物的蔗糖合成过程中，PFK 含量的上升能够引植物中蔗糖含量的下降[8]。因此我们推断，在PFK对梨果实糖分的积累有重要的影响，所有对PFK基因家族的研究，对提高梨果实品质有重要的意义。
磷酸果糖激酶（PFKs）作为糖酵解过程中的关键酶，包括两大类，一类是以ATP供体的磷酸果糖激酶(PFK，EC2.7.1.11)，一类是以焦磷酸为供体的磷酸转移酶(PFP，EC2.7.1.90)[3][11]，其中ATP供体磷酸果糖激酶PFK又可更具其催化产物分为PFK1和PFK2，其催化过程分别是将6磷酸果糖催化成为果糖1,6二磷酸和果糖2,6二磷酸，而以焦磷酸为供体PFP，其催化反应为将6磷酸果糖催化成为果糖1,6二磷酸。
1980年以来，在广泛的植物物种，比如：马铃薯[9]、蓖麻[10]、柑橘[11]、甘蔗[12]中都对PFP进行了分子水平的研究。除了植物以外，在一些微生物中，比如在拟无枝菌酸菌[13]和痢疾变形虫溶液[14]中也发现了PFP这种酶。研究证明，PFP存在2种结构，即Alpha和Beta结构[15、16]。同时有研究表明，PFP也许有利于植物适应胁迫环境，比如适应低氧胁迫和适应低磷酸盐环境[17、18]。尽管对于PFP有很多研究，但是其功能依旧没有完全被研究清楚。
与大量对于植物PFP的研究相比，对植物PFK的研究相对较少。在1988到1990年间，Cawood MC和Knowles VL等实验室对发芽的黄瓜种子、小麦和蓖麻中的PFK进行了特性分析[57]。1987年，Black CC在论文中表示，PFK的含量与活性与蔗糖的积累呈现负相关关系[8]。Angelika Mustroph、 Uwe Sonnewald等人在2007年对拟南芥中的PFK基因家族进行了分析[19]，该分析将PFP与PFK区分开来，强调了PFK在植物中的作用。而对于PFK基因家族的在其他植物中的表达和进化鲜有研究。
磷酸果糖激酶参与果实糖代谢，调节糖酵解的速度，其同源基因在不同的物种中，表达模式的差异较大，起着不同的功能。但在梨中会有怎样的表达模式及功能，该基因与其他功能相关基因相互之间的作用机理如何？这些都有待进一步研究。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 植物材料
实验材料为中国砀山酥梨，由大学梨工程中心提供，采样的梨树生长于江苏省南京市大学浦口基地，其茎、新叶、老叶、花丝、花药、花瓣、花托、果实于2015年生长期采集，采集4个时期的果实：早期（盛花期后15天）、中期（盛花期后39天）、近成熟期（盛花期后72天）、成熟期（盛花期后152天）。果实样品采集后清洗、去皮、切碎并及时用液氮冷冻。所有的样品放在80°C中冷冻储藏。
目录
摘要2
关键词2
Abstract2
Key words2
引言2
1 材料与方法3
1.1 材料 3
1.1.1 植物材料3
1.1.2 引物3
1.1.3 相关试剂和仪器4
1.2 方法 4
1.2.1 PFK基因家族的搜索和筛选4
1.2.2 PFK基因家族的序列比对分析与进化树分析4
1.2.3 PFK基因家族的外显子内含子结构分析及MEME 蛋白基序分析 4
1.2.4 PFK基因染色体定位、共线性分析和复制事件4
1.2.5 PFK基因同义突变率分析5
1.2.6 梨PFK基因果实发育转录组分析5
1.2.7 RNA提取及反转录5
1.2.8 半定量PCR表达分析5
2 结果与分析5
2．1梨PFK基因家族的生物信息学分析5
2.1.1 PFK基因家族基因确定 5
2.1.2 PFK基因家族进化树和家族分类6
2.1.3染色体定位及共线性分析8
2.1.4基因结构分析9
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
/> 2.1.5 PFK基因家族复制方式及同义突变分析10
2．2 PFK基因家族表达分析10
2.2.1果实发育时期PFK基因表达11
2.2.2组织特异性表达分析 11
3 讨论 12
3．1 PFK基因家族的进化分析 12
3．2 PFK基因家族基因的结构分析 12
3．3 PFK基因家族的复制模式 13
3．4 PFK基因家族的表达分析 13
参考文献 14
致谢15
梨PFK基因家族生物信息学及表达分析
引言
引言
梨是我国最重要的经济作物之一，梨果鲜美,肉脆多汁,酸甜可口,风味芳香优美。富含糖、蛋白质、脂肪、碳水化合物及多种维生素,对人体健康有重要作用。我国是梨属植物中心发源地之一,梨品质的提高对我国经济发展有重要的意义。而对果实的品质的改善提高经济效益的重要手段，果实的含糖量是果实品质的重要因素，对影响糖分因素的研究有重要的意义。近年来，白梨（Pyrus bretschneideri Rehd.）与西洋梨（P. communis L.）相继完成基因组测序和序列释放[1,2]，为在全基因组水平上研究梨重要功能的基因提供了基础数据。
糖酵解途径所有有机体中重要的新陈代谢途径，在园艺作物中，糖酵解作为除蔗糖山梨醇之外的碳水化合物的主要代谢途径，对植物的新陈代谢和糖分的积累有重要的影响。磷酸果糖激酶是糖酵解途径中的主要限速梅，并可以调节糖酸含量之间的平衡[4][14]。在已有的研究中，以及对小麦、发芽的黄瓜种子和蓖麻中的PFK进行了特性鉴定[5,6,7]。这些研究推测，在植物的蔗糖合成过程中，PFK 含量的上升能够引植物中蔗糖含量的下降[8]。因此我们推断，在PFK对梨果实糖分的积累有重要的影响，所有对PFK基因家族的研究，对提高梨果实品质有重要的意义。
磷酸果糖激酶（PFKs）作为糖酵解过程中的关键酶，包括两大类，一类是以ATP供体的磷酸果糖激酶(PFK，EC2.7.1.11)，一类是以焦磷酸为供体的磷酸转移酶(PFP，EC2.7.1.90)[3][11]，其中ATP供体磷酸果糖激酶PFK又可更具其催化产物分为PFK1和PFK2，其催化过程分别是将6磷酸果糖催化成为果糖1,6二磷酸和果糖2,6二磷酸，而以焦磷酸为供体PFP，其催化反应为将6磷酸果糖催化成为果糖1,6二磷酸。
1980年以来，在广泛的植物物种，比如：马铃薯[9]、蓖麻[10]、柑橘[11]、甘蔗[12]中都对PFP进行了分子水平的研究。除了植物以外，在一些微生物中，比如在拟无枝菌酸菌[13]和痢疾变形虫溶液[14]中也发现了PFP这种酶。研究证明，PFP存在2种结构，即Alpha和Beta结构[15、16]。同时有研究表明，PFP也许有利于植物适应胁迫环境，比如适应低氧胁迫和适应低磷酸盐环境[17、18]。尽管对于PFP有很多研究，但是其功能依旧没有完全被研究清楚。
与大量对于植物PFP的研究相比，对植物PFK的研究相对较少。在1988到1990年间，Cawood MC和Knowles VL等实验室对发芽的黄瓜种子、小麦和蓖麻中的PFK进行了特性分析[57]。1987年，Black CC在论文中表示，PFK的含量与活性与蔗糖的积累呈现负相关关系[8]。Angelika Mustroph、 Uwe Sonnewald等人在2007年对拟南芥中的PFK基因家族进行了分析[19]，该分析将PFP与PFK区分开来，强调了PFK在植物中的作用。而对于PFK基因家族的在其他植物中的表达和进化鲜有研究。
磷酸果糖激酶参与果实糖代谢，调节糖酵解的速度，其同源基因在不同的物种中，表达模式的差异较大，起着不同的功能。但在梨中会有怎样的表达模式及功能，该基因与其他功能相关基因相互之间的作用机理如何？这些都有待进一步研究。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 植物材料
实验材料为中国砀山酥梨，由大学梨工程中心提供，采样的梨树生长于江苏省南京市大学浦口基地，其茎、新叶、老叶、花丝、花药、花瓣、花托、果实于2015年生长期采集，采集4个时期的果实：早期（盛花期后15天）、中期（盛花期后39天）、近成熟期（盛花期后72天）、成熟期（盛花期后152天）。果实样品采集后清洗、去皮、切碎并及时用液氮冷冻。所有的样品放在80°C中冷冻储藏。
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