利用ssr标记对砂梨栽培种遗传多样性的研究
摘要：由于砂梨(P. pyrifolia)本身的自交不亲和特性导致不同地区品种间基因存在较大差异。为鉴定品种资源的多样性，探索重要的遗传特性，本研究利用17对核心简单重复序列(simple sequence repeat, SSR)标记对48份砂梨品种资源进行遗传多样性分析。结果表明，砂梨种质资源表现出丰富的遗传多样性。所有SSR引物共检测到124个等位基因，每个SSR位点平均扩增7.29个；48份砂梨品种的观测等位基因数(observed number of alleles, Na)、有效等位基因数(effective number of alleles, Ne)、观测杂合度(observed heterozygosity, Ho)、期望杂合度(expected heterozygosity, He)以及 Shannon 信息指数(Shannonsinformation index, I)平均值分别为7.29、4.32、0.62、0.76和 1.57；遗传相似系数和聚类分析结果表明，48份砂梨具有较高的遗传多样性，且品种的演化趋势较均匀，不同地区品种相互交织在一起，更加体现了砂梨之间广泛的基因交流。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1材料 2
1.2方法 2
1.2.1砂梨DNA提取和检测 2
1.2.2 SSR引物的筛选2
1.2.3 PCR扩增和产物检测2
1.2.4数据分析2
2结果与分析3
2.1 SSR标记的扩增与多态性分析 3
2.2 基于SSR遗传多态性的砂梨种质资源聚类分析 4
3讨论5
3．1砂梨的杂合特性分析5
3. 2 SSR标记揭示的砂梨等位基因数量5
3.3 48个砂梨品种的聚类分析5
致谢6
参考文献6
图1引物NAUpy36e对48份砂梨品种的扩增图谱 3
图2 48个砂梨品种聚类分析图5
表1 48份砂梨品种3
表2
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥3^5`1^9`1^6^0`7^2$
17对核心SSR标记多态性 4
利用SSR标记对砂梨栽培种遗传多样性的研究
园艺113 陈晨
引言
引言
梨属于蔷薇科(Rosaceae)梨属(Pyrus)植物，在亚洲已经有2千年多年的种植历史。砂梨（P. pyrifolia）在我国具有悠久的栽培历史，易栽培、产量高、经济寿命长,为我国栽培梨的主要种类,且适应能力强,喜温暖湿润的环境,主要分布在我国淮河流域以南地区，并广泛分布于我国长江流域及其中下游地区，包括四川、湖北、安徽、浙江、广西、福建和贵州等地。由于梨本身的自交不亲和性及长期以来的自然选择和人工驯化，使得砂梨品种间存在较高的遗传多样性。
国外研究者曾利用分子标记对砂梨种质资源遗传多样性进行分析。Chikako Nishitani等(2009)利用11个不同品种的砂梨cDNA开发了73个新SSR标记，并且这些SSR标记在10个日本梨和10个欧洲梨的遗传多样性研究中显示出高多态性的SSR标记杂合度。
近年来，我国学者利用SSR分子标记也对砂梨进行了一些研究，如路娟等(2011)利用25对梨SSR分子标记将150份包含白梨、砂梨、秋子梨和西洋梨种质分为两大类群，其中中国的白梨、砂梨和秋子梨相互交错在一起，没有独立成组，并且砂梨表现出最丰富的遗传多样性。王铤等（2008）应用精确预测法进行了砂梨核nSSR的开发,为梨属果树及其近缘种遗传结构、亲缘关系等方面的研究提供有效工具，并初步构建了砂梨砂梨分子遗传图谱。Teng等（2002）采用RAPD标记分析也发现日本梨品种与中国砂梨尤其是来自中国浙江省和福建省的中国砂梨遗传背景相似; 并且认为东亚主栽的白梨、中国砂梨和日本梨系统可能起源于共同的祖先。
SSR标记能够对砂梨种质资源的遗传多样性进行全面的评价，这些为砂梨的分类以及后期开展分子标记辅助育种(markerassisted selection,MAS)提供了很好的借鉴作用。同时，综合前人的研究发现，目前利用SSR标记对包括砂梨在内的梨属植物进行遗传多样性分析和资源评价中，所利用的SSR标记数量较少，不清楚所用的SSR标记在染色体上的分布情况。随着砀山酥梨全基因组数据的公布，大量的SSR标记得以开发，本实验筛选出覆盖全梨17个染色体的核心SSR标记对砂梨品种进行了遗传多样性分析。为探讨提出的核心SSR标记在砂梨资源遗传多样性研究中的应用价值。本研究采用SSR标记，对48份砂梨品种资源进行了遗传多样性分析，以期为全面评价和合理利用砂梨资源提供科学依据。
1 材料与方法
1．1 材料
供试的48份砂梨（P.pyrifolia）种质资源采自大学江浦农场梨资源圃。于春天采集幼嫩的叶片，经液氮速冻后冷藏于80℃冰箱。48份砂梨品种如表1所示。
1．2 方法
1.2.1 砂梨DNA 提取和检测
DNA提取采用改良CTAB法(毕方铖等,2006)。将提取的DNA经过NanoDrap2000确定浓度后，稀释至终浓度为30 ng/μL，于80℃冰箱保存。
1.2.2 SSR引物的筛选
利用已公布砀山酥梨全基因组数据(Wu et al., 2013)，本实验在数据组装的基础上开发大量梨的SSR标记。根据这些SSR标记在染色体上的分布情况、以及在以往研究中多态性情况，筛选17对分布在不同染色体，多态性高的SSR引物。
1.2.3 PCR扩增和产物的检测
采用本实验室（Song等，2014）建立的SSR扩增反应体系和程序。产物的检测通过8%非变性聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel, PAGE)电泳检测，以 pBR322 DNA MspⅠ(BeijingBLKW Biotechnology Co, Ltd)作为标准条带，确定扩增条带的大小。电泳结果采用银染法进行显色后，拍照观察。
1.2.4 数据分析
根据标准DNA marker所指示的大小，按照共显性的方式进行条带统计。利用 POPGENE version 2.0 软件对基因型数据进行计算，分析的指标为观测等位基因数 (observed number of alleles, Na)、有效等位基因数(effective number of alleles, Ne)、观测杂合度(observed heterozygosity, Ho)、期望杂合度(expected heterozygosity,He)以及Shannon信息指数(Shannons information index, I)。利用SPSS 18.0软件对参数结果进行t检测。将每个标记扩增的条带迁移率，根据Nei和 Li(1979)方法计算相似系数，建立相似矩阵；最后利用NTSYSpc程序中的非加权组平均法(unweighted pair group method with arithmetic means, UPGMA)生成系统树。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1材料 2
1.2方法 2
1.2.1砂梨DNA提取和检测 2
1.2.2 SSR引物的筛选2
1.2.3 PCR扩增和产物检测2
1.2.4数据分析2
2结果与分析3
2.1 SSR标记的扩增与多态性分析 3
2.2 基于SSR遗传多态性的砂梨种质资源聚类分析 4
3讨论5
3．1砂梨的杂合特性分析5
3. 2 SSR标记揭示的砂梨等位基因数量5
3.3 48个砂梨品种的聚类分析5
致谢6
参考文献6
图1引物NAUpy36e对48份砂梨品种的扩增图谱 3
图2 48个砂梨品种聚类分析图5
表1 48份砂梨品种3
表2
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥3^5`1^9`1^6^0`7^2$
17对核心SSR标记多态性 4
利用SSR标记对砂梨栽培种遗传多样性的研究
园艺113 陈晨
引言
引言
梨属于蔷薇科(Rosaceae)梨属(Pyrus)植物，在亚洲已经有2千年多年的种植历史。砂梨（P. pyrifolia）在我国具有悠久的栽培历史，易栽培、产量高、经济寿命长,为我国栽培梨的主要种类,且适应能力强,喜温暖湿润的环境,主要分布在我国淮河流域以南地区，并广泛分布于我国长江流域及其中下游地区，包括四川、湖北、安徽、浙江、广西、福建和贵州等地。由于梨本身的自交不亲和性及长期以来的自然选择和人工驯化，使得砂梨品种间存在较高的遗传多样性。
国外研究者曾利用分子标记对砂梨种质资源遗传多样性进行分析。Chikako Nishitani等(2009)利用11个不同品种的砂梨cDNA开发了73个新SSR标记，并且这些SSR标记在10个日本梨和10个欧洲梨的遗传多样性研究中显示出高多态性的SSR标记杂合度。
近年来，我国学者利用SSR分子标记也对砂梨进行了一些研究，如路娟等(2011)利用25对梨SSR分子标记将150份包含白梨、砂梨、秋子梨和西洋梨种质分为两大类群，其中中国的白梨、砂梨和秋子梨相互交错在一起，没有独立成组，并且砂梨表现出最丰富的遗传多样性。王铤等（2008）应用精确预测法进行了砂梨核nSSR的开发,为梨属果树及其近缘种遗传结构、亲缘关系等方面的研究提供有效工具，并初步构建了砂梨砂梨分子遗传图谱。Teng等（2002）采用RAPD标记分析也发现日本梨品种与中国砂梨尤其是来自中国浙江省和福建省的中国砂梨遗传背景相似; 并且认为东亚主栽的白梨、中国砂梨和日本梨系统可能起源于共同的祖先。
SSR标记能够对砂梨种质资源的遗传多样性进行全面的评价，这些为砂梨的分类以及后期开展分子标记辅助育种(markerassisted selection,MAS)提供了很好的借鉴作用。同时，综合前人的研究发现，目前利用SSR标记对包括砂梨在内的梨属植物进行遗传多样性分析和资源评价中，所利用的SSR标记数量较少，不清楚所用的SSR标记在染色体上的分布情况。随着砀山酥梨全基因组数据的公布，大量的SSR标记得以开发，本实验筛选出覆盖全梨17个染色体的核心SSR标记对砂梨品种进行了遗传多样性分析。为探讨提出的核心SSR标记在砂梨资源遗传多样性研究中的应用价值。本研究采用SSR标记，对48份砂梨品种资源进行了遗传多样性分析，以期为全面评价和合理利用砂梨资源提供科学依据。
1 材料与方法
1．1 材料
供试的48份砂梨（P.pyrifolia）种质资源采自大学江浦农场梨资源圃。于春天采集幼嫩的叶片，经液氮速冻后冷藏于80℃冰箱。48份砂梨品种如表1所示。
1．2 方法
1.2.1 砂梨DNA 提取和检测
DNA提取采用改良CTAB法(毕方铖等,2006)。将提取的DNA经过NanoDrap2000确定浓度后，稀释至终浓度为30 ng/μL，于80℃冰箱保存。
1.2.2 SSR引物的筛选
利用已公布砀山酥梨全基因组数据(Wu et al., 2013)，本实验在数据组装的基础上开发大量梨的SSR标记。根据这些SSR标记在染色体上的分布情况、以及在以往研究中多态性情况，筛选17对分布在不同染色体，多态性高的SSR引物。
1.2.3 PCR扩增和产物的检测
采用本实验室（Song等，2014）建立的SSR扩增反应体系和程序。产物的检测通过8%非变性聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel, PAGE)电泳检测，以 pBR322 DNA MspⅠ(BeijingBLKW Biotechnology Co, Ltd)作为标准条带，确定扩增条带的大小。电泳结果采用银染法进行显色后，拍照观察。
1.2.4 数据分析
根据标准DNA marker所指示的大小，按照共显性的方式进行条带统计。利用 POPGENE version 2.0 软件对基因型数据进行计算，分析的指标为观测等位基因数 (observed number of alleles, Na)、有效等位基因数(effective number of alleles, Ne)、观测杂合度(observed heterozygosity, Ho)、期望杂合度(expected heterozygosity,He)以及Shannon信息指数(Shannons information index, I)。利用SPSS 18.0软件对参数结果进行t检测。将每个标记扩增的条带迁移率，根据Nei和 Li(1979)方法计算相似系数，建立相似矩阵；最后利用NTSYSpc程序中的非加权组平均法(unweighted pair group method with arithmetic means, UPGMA)生成系统树。
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