拟南芥tdna插入突变体及其脱落酸相关表型的鉴定
拟南芥是一种生活周期短、遗传背景清晰、易于转基因操作，并且易于种植的一类草本植物，因此它在植物学的各种研究领域中得到了广泛的应用。拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定对于研究植物基因的功能起着重要作用。脱落酸是植物合成的具有重要生物学功能的植物激素，它可以抑制拟南芥幼苗的生长。本研究拟通过提取拟南芥DNA并设计基因特异性引物对拟南芥的32个基因的T-DNA插入突变体进行鉴定，得到了9个基因的纯合突变体的种子。然后对这9个基因的纯合T-DNA插入突变体进行脱落酸生长表型的鉴定，结果发现了A3基因的突变可以使植物对ABA敏感性增强，其他基因的突变不能改变植物对ABA的敏感性，说明了A3基因响应脱落酸，其他基因不响应。本论文的研究对于研究和鉴定参与脱落酸信号转导的基因有着重要意义。关键词 拟南芥，脱落酸，T-DNA突变体，信号转导
目 录
1 引言 1
1.1 TDNA插入技术概述 1
1.2 TDNA插入技术的载体 1
1.3 脱落酸的生理功能 2
1.4 ABA的信号转导概述 3
1.5 本课题的目的和意义 3
2 材料与方法 3
2.1 实验材料 3
2.2 实验仪器 3
2.3 实验试剂 4
2.4 常用溶液 4
2.5 实验设计 4
2.6 实验中所用到的引物: 6
3 结果与分析 10
3.1 通过PCR得到的结果 10
3.2 通过表型鉴定得到的结果 12
4 讨论 13
结 论 14
致 谢 15
参 考 文 献 16
1 引言
拟南芥 (Arabidopsis thaliana)，学名鼠耳芥，别称阿拉伯草、阿拉伯芥、阿拉伯鼠耳芥等，它是十字花科拟南芥属，二年生草本植物类[1]。它是细弱草本，高度约7至40厘米，成熟植株一般高20至30厘米高。在植物遗传学、发育生物学等领域有着广泛的研究，已经成为了一种典型的模式植物（model plant）[2]，这是首次在开花植物中被完全测序的植物基因组[3]。广泛研究的原因主要是因为该植 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
物具有以下优点：植株个体小（节省种植空间）、生长周期快（从发芽到开花不超过6周）、种子繁殖系数高（一株拟南芥能产生上万粒种子）、生命力强（生长条件易于人工调控，普通培养基就可作人工培养），适于在温室大规模栽培[4]，分布广泛。拟南芥的基因组是目前已知植物基因组中最小的[5]，每个单倍染色体组只有小麦染色体组长的1/80，并且它属于自花授粉植物，避免了植株间的传粉，其基因具有高度纯合性，用理化因素处理突变率很高，很容易获得不同突变体的不同表型，如植物激素突变体、光形态建成突变体等[611]。因此，拟南芥被科学家誉为“植物中的果蝇”[12]。
1.1 TDNA插入技术概述
TDNA是从根癌农杆菌入侵植物细胞时，从Ti质粒上分离出来并整合到植物基因组中的一段DNA片段[13]。TDNA 技术是构建突变体库，反向遗传学的突破性技术之一[14]。拟南芥插入突变的主要方法可以通过TDNA整合，TDNA整合成串联形式排列，由于拟南芥中没有内源的标签因子存在，因此在拟南芥的基因组中TDNA的插入位点显得十分重要[15]。在起初的研究中，科学家们认为TDNA在基因组中的整合是一个随机过程[16]，但最近的研究中又有了新的突破，这种随机可能不是绝对的，它在基因组中的插入位点是有选择性的，TDNA常常喜欢在染色体中基因丰富、转录活性高的区域进行集成[17]，并且在非编码区基因和启动子的TDNA基因插入式无趋势区和重复区为低频率，在插入基因类型上TDNA没有倾向性。An和其他研究表明TDNA在染色体末端，插入的频率较高，而在着丝点处插入的频率较低[1819]。在拟南芥等模式植物的突变体库中该技术得到了广泛的运用。
1.2 TDNA插入技术的载体
通过人们近年来的不断研究突破，常用TDNA插入技术的载体有以下3种。
（1）插入突变载体
TDNA最初就被使用在插入突变载体，其具有特点是在左右边界内只包含一个选择标记性基因。当某个基因中插入TDNA时，该基因的表达被TDNA破坏，当基因缺失后的突变表型产生的时候，我们就把这些叫做基因敲除[20]。但在这类载体构建的体库中它却存在着很大的局限性，对于基因家族或是遗传冗余基因来说，能获得部分突变体但是这些突变体的基因功能都是缺失的，因此如果不能得到有功能冗余和致死效应的基因突变体，就很难对具有高度多效性的基因进行研究[21]。
（2）基因捕获载体
基因捕获技术是一种报告基因随机整合技术，通过报告基因与目的基因的融合来检测这类载体基因的活性[22]。它包括三部分，分别是增强子捕获、启动子捕获和基因捕获载体。
（3）激活标签载体
通过激活标签载体能够研究存在功能冗余或致死效应的基因以及具有高度多效性的基因的功能，成功的弥补了最初的TDNA插入突变载体的不足的缺点，在这类载体中能够产生获得功能性的突变体，它是在TDNA的一端安置一个强启动子或几个连续的增强子[23]。它区别其它突变方法的优势是方便采用了TAIL –PCR和质粒挽救方法扩增相关基因，降低了T DNA突变分离功能基因的不便[24]。由于通过激活标签法诱导突变的效率极其的低，能够产生显性的表型改变仅有千分之一左右。
1.3 脱落酸的生理功能
在20世纪60年代脱落酸（abscisic acid, ABA）被人们发现，人们称它为脱落酸的原因是它具有诱导植物叶片脱落的能力。它是在植物体内合成的一种重要激素，它具有调控种子萌发和成熟、侧根发育、叶片衰老以及气孔运动以及植物生长发育过程的功能，同时，还参与了调控植物对外界各种非生物胁迫的响应，包括干旱、低温、高盐和紫外辐射等[25]。
在植物对抗生物胁迫中，ABA也起着重要的调节作用，如病原菌的侵染。ABA抑制病原菌的侵入可以通过调节气孔关闭来控制，还能通过一系列的调控机制干扰植物本身的防御反应，增强患病叶片的感染性，加快患病叶片的死亡，从而有效抑制病菌的扩散[26]。在植物适应环境应激反应方面ABA发挥至关重要的作用，能使植物对病原体产生抗性、并且能够激活拟南芥内的防御机制[27]。ABA通过参与植物体内极其复杂的信号转导网络来体现了ABA生理功能的多样性[28]。
1.4 ABA的信号转导概述
随着人们对分子生物学、遗传学、细胞生物学及结构生物学的不断探讨，使人们对ABA信号的感知、代谢、运输过程以及传递过程的研究得到了深入的了解，当前，已经发现有100多个作用因子与ABA信号转导相关并相互联系起来。这些因子包括：细胞质中的CBL互作蛋白激酶(CIPK)、钙依赖型蛋白激酶(CDPK)、分裂素活化蛋白激酶(MAPK)、2C/A型蛋白磷酸酶(PP2C/A)，以及位于细胞膜上的白磷酸酶C/D、G蛋白、类受体蛋白激酶、SNF1相关的蛋白激酶(SnRK)，位于细胞质中的CBL互作蛋白激酶(CIPK)、钙依赖型蛋白激酶(CDPK)、分裂素活化蛋白激酶(MAPK)、2C/A型蛋白磷酸酶(PP2C/A)、E3连接酶以及多种转录因子等[2930]。另外，被发现参与ABA信号转导的胞内第二信使有，钙离子、环化核苷酸、活性氧簇和磷脂类等。
目 录
1 引言 1
1.1 TDNA插入技术概述 1
1.2 TDNA插入技术的载体 1
1.3 脱落酸的生理功能 2
1.4 ABA的信号转导概述 3
1.5 本课题的目的和意义 3
2 材料与方法 3
2.1 实验材料 3
2.2 实验仪器 3
2.3 实验试剂 4
2.4 常用溶液 4
2.5 实验设计 4
2.6 实验中所用到的引物: 6
3 结果与分析 10
3.1 通过PCR得到的结果 10
3.2 通过表型鉴定得到的结果 12
4 讨论 13
结 论 14
致 谢 15
参 考 文 献 16
1 引言
拟南芥 (Arabidopsis thaliana)，学名鼠耳芥，别称阿拉伯草、阿拉伯芥、阿拉伯鼠耳芥等，它是十字花科拟南芥属，二年生草本植物类[1]。它是细弱草本，高度约7至40厘米，成熟植株一般高20至30厘米高。在植物遗传学、发育生物学等领域有着广泛的研究，已经成为了一种典型的模式植物（model plant）[2]，这是首次在开花植物中被完全测序的植物基因组[3]。广泛研究的原因主要是因为该植 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
物具有以下优点：植株个体小（节省种植空间）、生长周期快（从发芽到开花不超过6周）、种子繁殖系数高（一株拟南芥能产生上万粒种子）、生命力强（生长条件易于人工调控，普通培养基就可作人工培养），适于在温室大规模栽培[4]，分布广泛。拟南芥的基因组是目前已知植物基因组中最小的[5]，每个单倍染色体组只有小麦染色体组长的1/80，并且它属于自花授粉植物，避免了植株间的传粉，其基因具有高度纯合性，用理化因素处理突变率很高，很容易获得不同突变体的不同表型，如植物激素突变体、光形态建成突变体等[611]。因此，拟南芥被科学家誉为“植物中的果蝇”[12]。
1.1 TDNA插入技术概述
TDNA是从根癌农杆菌入侵植物细胞时，从Ti质粒上分离出来并整合到植物基因组中的一段DNA片段[13]。TDNA 技术是构建突变体库，反向遗传学的突破性技术之一[14]。拟南芥插入突变的主要方法可以通过TDNA整合，TDNA整合成串联形式排列，由于拟南芥中没有内源的标签因子存在，因此在拟南芥的基因组中TDNA的插入位点显得十分重要[15]。在起初的研究中，科学家们认为TDNA在基因组中的整合是一个随机过程[16]，但最近的研究中又有了新的突破，这种随机可能不是绝对的，它在基因组中的插入位点是有选择性的，TDNA常常喜欢在染色体中基因丰富、转录活性高的区域进行集成[17]，并且在非编码区基因和启动子的TDNA基因插入式无趋势区和重复区为低频率，在插入基因类型上TDNA没有倾向性。An和其他研究表明TDNA在染色体末端，插入的频率较高，而在着丝点处插入的频率较低[1819]。在拟南芥等模式植物的突变体库中该技术得到了广泛的运用。
1.2 TDNA插入技术的载体
通过人们近年来的不断研究突破，常用TDNA插入技术的载体有以下3种。
（1）插入突变载体
TDNA最初就被使用在插入突变载体，其具有特点是在左右边界内只包含一个选择标记性基因。当某个基因中插入TDNA时，该基因的表达被TDNA破坏，当基因缺失后的突变表型产生的时候，我们就把这些叫做基因敲除[20]。但在这类载体构建的体库中它却存在着很大的局限性，对于基因家族或是遗传冗余基因来说，能获得部分突变体但是这些突变体的基因功能都是缺失的，因此如果不能得到有功能冗余和致死效应的基因突变体，就很难对具有高度多效性的基因进行研究[21]。
（2）基因捕获载体
基因捕获技术是一种报告基因随机整合技术，通过报告基因与目的基因的融合来检测这类载体基因的活性[22]。它包括三部分，分别是增强子捕获、启动子捕获和基因捕获载体。
（3）激活标签载体
通过激活标签载体能够研究存在功能冗余或致死效应的基因以及具有高度多效性的基因的功能，成功的弥补了最初的TDNA插入突变载体的不足的缺点，在这类载体中能够产生获得功能性的突变体，它是在TDNA的一端安置一个强启动子或几个连续的增强子[23]。它区别其它突变方法的优势是方便采用了TAIL –PCR和质粒挽救方法扩增相关基因，降低了T DNA突变分离功能基因的不便[24]。由于通过激活标签法诱导突变的效率极其的低，能够产生显性的表型改变仅有千分之一左右。
1.3 脱落酸的生理功能
在20世纪60年代脱落酸（abscisic acid, ABA）被人们发现，人们称它为脱落酸的原因是它具有诱导植物叶片脱落的能力。它是在植物体内合成的一种重要激素，它具有调控种子萌发和成熟、侧根发育、叶片衰老以及气孔运动以及植物生长发育过程的功能，同时，还参与了调控植物对外界各种非生物胁迫的响应，包括干旱、低温、高盐和紫外辐射等[25]。
在植物对抗生物胁迫中，ABA也起着重要的调节作用，如病原菌的侵染。ABA抑制病原菌的侵入可以通过调节气孔关闭来控制，还能通过一系列的调控机制干扰植物本身的防御反应，增强患病叶片的感染性，加快患病叶片的死亡，从而有效抑制病菌的扩散[26]。在植物适应环境应激反应方面ABA发挥至关重要的作用，能使植物对病原体产生抗性、并且能够激活拟南芥内的防御机制[27]。ABA通过参与植物体内极其复杂的信号转导网络来体现了ABA生理功能的多样性[28]。
1.4 ABA的信号转导概述
随着人们对分子生物学、遗传学、细胞生物学及结构生物学的不断探讨，使人们对ABA信号的感知、代谢、运输过程以及传递过程的研究得到了深入的了解，当前，已经发现有100多个作用因子与ABA信号转导相关并相互联系起来。这些因子包括：细胞质中的CBL互作蛋白激酶(CIPK)、钙依赖型蛋白激酶(CDPK)、分裂素活化蛋白激酶(MAPK)、2C/A型蛋白磷酸酶(PP2C/A)，以及位于细胞膜上的白磷酸酶C/D、G蛋白、类受体蛋白激酶、SNF1相关的蛋白激酶(SnRK)，位于细胞质中的CBL互作蛋白激酶(CIPK)、钙依赖型蛋白激酶(CDPK)、分裂素活化蛋白激酶(MAPK)、2C/A型蛋白磷酸酶(PP2C/A)、E3连接酶以及多种转录因子等[2930]。另外，被发现参与ABA信号转导的胞内第二信使有，钙离子、环化核苷酸、活性氧簇和磷脂类等。
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