葡萄果实中淀粉代谢基因水平上的鉴定分析
为了对葡萄果实发育过程中淀粉积累和降解机理有进一步的认识，本实验研究分析了葡萄果实发育过程中淀粉含量的变化趋势，运用实时荧光定量PCR技术依次对4个淀粉代谢关键酶基因（VvAPS、VvAPL、VvAMY1、VvBAM1）的cDNA序列片段进行扩增，并以叶片为对照，对果实幼果的昼夜变化及发育过程中的淀粉含量、相关酶活性进行测定，据此研究其表达分析与调控机理。结果显示，幼果期积累了少量淀粉，而在果实发育中后期至成熟期果肉中则基本无淀粉存在，仅果皮中仍存在微量淀粉；AMY和BMY酶活性在幼果期较弱，而成熟期较强，相关基因表达变化与酶活性变化一致，VvAPS在葡萄整个发育期表达量均较高，而VvAPL则与淀粉变化相关性不明显。由此推断出幼果阶段淀粉的积累以VvAPS基因合成淀粉为主，而成熟阶段以VvAMY1和VvBAM1降解淀粉为主。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
1 材料与方法 2
1.1 研究材料 2
1.2 试验方法 2
1.2.1 淀粉代谢关键酶活性的测定 2
1.2.2 淀粉含量的测定 2
1.2.3 淀粉代谢途径相关基因的定量表达 2
2 结果与分析 4
2.1 淀粉代谢途径相关基因的定量表达 4
2.1.1 葡萄果实、叶片的总RNA 4
2.1.2 葡萄各组织总RNA提取纯度检测 4
2.1.3 引物设计序列与扩增片段 5
2.2 葡萄果实发育阶段果皮与果肉组织中淀粉代谢变化 5
2.2.1 发育过程中的淀粉含量的变化 5
2.2.2 酶活性发育过程中的变化特征 6
2.2.3 葡萄果实果肉、果皮发育过程中淀粉相关酶基因表达分析 7
2.3 葡萄幼果昼夜淀粉代谢变化 8
2.3.1 淀粉含量日动态变化(以花后12天为例) 8
2. *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
3.2 酶活性日动态变化特征(以花后12天为例) 9
2.3.3 葡萄果实、叶片淀粉相关酶基因日变化表达分析(以花后12天为例) 9
3 讨论 10
3.1 讨论 10
3.2 结论 11
致谢 11
参考文献 11
图11 葡萄果实、叶片总RNA 5
图12 葡萄各组织总RNA 5
图13 VvAPS、VvAPL、VvAMY1、VvBAM1的扩增片段 5
图2 葡萄果实在发育过程中的淀粉含量变化 6
图3 果实发育阶段果肉与果皮组织中淀粉代谢酶活性动态变化 7
图4 APS、APL、AMY1、BAM1相对表达量在发育过程中的变化 8
图5 葡萄果实一天中各时段的淀粉含量变化 8
图6 葡萄果实中三种不同酶在一天中的活性变化 9
图7 APS、APL、AMY1、BAM1相对表达量的日变化 9
表1 引物序列及片段大小 5
葡萄果实中淀粉代谢基因水平上的鉴定分析
引言
引言：葡萄（Vitis vinifera L.）是世界性重要果树，也是我国果树生产中重要的树种。葡萄作为世界上重要的鲜食果品和加工原料，糖分积累的过程是果实发育与品质形成的关键 [1,2] 。因此，有关葡萄中糖代谢途径的研究一直是国内外果树研究领域的一个热点和重点[3,4]。其中，淀粉在植物体内普遍存在，是果实发育过程中的过渡形式、暂存形式，也是最重要的贮藏性多糖，贮存于活细胞内有生活力的叶绿体或质体中，Dinar and Stevens[5]首次发现果实发育早期淀粉的积累可以为后期糖的合成储备碳源[6]。淀粉代谢因此是葡萄中糖代谢的重要组成部分，其合成和分解与果实的产量和品质密切相关。
以往的研究，通过化学分析的方法仅能从现象上解释其淀粉代谢的过程，而无法从根本上解释其代谢的原因[79]，且人们对于葡萄果实的认识十分有限，因此本研究以文献报道中葡萄幼果期含少量淀粉[10]，而其他发育时期几乎不含淀粉的结论为切入点[11]，首先通过对葡萄果实成熟过程中各阶段淀粉合成途径的ADP葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)以及淀粉降解途径关键酶淀粉水解酶(αAmylase和βAmylase)两种酶的活性进行测定，之后以模式植物拟南芥中淀粉代谢相关酶基因VvAPL、VvAPS、VvAMY1和VvBAM1的cDNA序列全长为探针，对葡萄基因组数据库进行BLAST比对，获得与拟南芥序列同源性最高的葡萄预测的CDS序列，利用实时荧光定量PCR技术，对这些基因进行表达分析与调控机理的研究。使人们进一步从分子水平上认识葡萄中淀粉代谢过程，对了解葡萄淀粉代谢调控机理，提高葡萄果实品质，具有重大意义。
1 材料与方法
1.1 研究材料
试材为种植于江苏省农业科学院果树种质圃适应性强、果粒大小均匀、糖分含量高的葡萄品种‘甬优1号’，于2012年5月中旬8月中旬即“甬优1号”一次果期进行分阶段采集样本。
采样当天进行及时处理，去籽，并将果肉果皮分离，分别用液氮迅速冷冻，于40℃保存备用。叶片做同样处理，作为实验对照。由此共得到12组幼果样品、6组果皮样品、6组果肉样品、18组叶片样品，共计42组样品，作为供试材料。
1.2 试验方法
1.2.1 淀粉代谢关键酶活性的测定
1.酶液制备：
称取果肉（皮）1 g或叶片0.5g，置于预冷的研钵中，加2 mL 预冷的0.1 molL1 柠檬酸溶液(pH5.6)和少量石英砂研磨，将匀浆移入10 mL 的离心管中，再分别用1 mL的0.1 molL1柠檬酸缓冲液(pH 5.6)冲洗2 次, 在3000r/min下离心10min，上清液转移入100ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为淀粉酶原液（酶液I）。吸取上述淀粉酶原液200μL，稀释至1mL，摇匀，即为淀粉酶稀释液（酶液II）。
2.AGPase酶(Adenosine diphosphateglucose pyrophosphoyrlase)活性测定
方法参照Zabawinski 等[13]，并略有改动。反应液组成：100 mmol/L HEPESNaOH (pH 7.4)，5 mmol/L MgCl2，1.2 mmol/LADPG，3 mmol/L焦磷酸钠，4 mmol/L DTT和酶液100 μL，共650 μL。37 ℃保温30 min后置于沸水30 s终止反应。反应完的溶液转移至离心管，12000 rpm 4℃离心10 min。取出部分上清液，与15μL 10mmol/L NADP混合，以反应液作参比在340 nm下比色。然后加入0.4U的磷酸葡萄糖变位酶和0.35 U的6磷酸葡萄糖脱氢酶，37℃保温lh，以重蒸水作参比，与A340下测定吸光值。两次比色测定值之差即为NADP的消耗量。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
1 材料与方法 2
1.1 研究材料 2
1.2 试验方法 2
1.2.1 淀粉代谢关键酶活性的测定 2
1.2.2 淀粉含量的测定 2
1.2.3 淀粉代谢途径相关基因的定量表达 2
2 结果与分析 4
2.1 淀粉代谢途径相关基因的定量表达 4
2.1.1 葡萄果实、叶片的总RNA 4
2.1.2 葡萄各组织总RNA提取纯度检测 4
2.1.3 引物设计序列与扩增片段 5
2.2 葡萄果实发育阶段果皮与果肉组织中淀粉代谢变化 5
2.2.1 发育过程中的淀粉含量的变化 5
2.2.2 酶活性发育过程中的变化特征 6
2.2.3 葡萄果实果肉、果皮发育过程中淀粉相关酶基因表达分析 7
2.3 葡萄幼果昼夜淀粉代谢变化 8
2.3.1 淀粉含量日动态变化(以花后12天为例) 8
2. *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
3.2 酶活性日动态变化特征(以花后12天为例) 9
2.3.3 葡萄果实、叶片淀粉相关酶基因日变化表达分析(以花后12天为例) 9
3 讨论 10
3.1 讨论 10
3.2 结论 11
致谢 11
参考文献 11
图11 葡萄果实、叶片总RNA 5
图12 葡萄各组织总RNA 5
图13 VvAPS、VvAPL、VvAMY1、VvBAM1的扩增片段 5
图2 葡萄果实在发育过程中的淀粉含量变化 6
图3 果实发育阶段果肉与果皮组织中淀粉代谢酶活性动态变化 7
图4 APS、APL、AMY1、BAM1相对表达量在发育过程中的变化 8
图5 葡萄果实一天中各时段的淀粉含量变化 8
图6 葡萄果实中三种不同酶在一天中的活性变化 9
图7 APS、APL、AMY1、BAM1相对表达量的日变化 9
表1 引物序列及片段大小 5
葡萄果实中淀粉代谢基因水平上的鉴定分析
引言
引言：葡萄（Vitis vinifera L.）是世界性重要果树，也是我国果树生产中重要的树种。葡萄作为世界上重要的鲜食果品和加工原料，糖分积累的过程是果实发育与品质形成的关键 [1,2] 。因此，有关葡萄中糖代谢途径的研究一直是国内外果树研究领域的一个热点和重点[3,4]。其中，淀粉在植物体内普遍存在，是果实发育过程中的过渡形式、暂存形式，也是最重要的贮藏性多糖，贮存于活细胞内有生活力的叶绿体或质体中，Dinar and Stevens[5]首次发现果实发育早期淀粉的积累可以为后期糖的合成储备碳源[6]。淀粉代谢因此是葡萄中糖代谢的重要组成部分，其合成和分解与果实的产量和品质密切相关。
以往的研究，通过化学分析的方法仅能从现象上解释其淀粉代谢的过程，而无法从根本上解释其代谢的原因[79]，且人们对于葡萄果实的认识十分有限，因此本研究以文献报道中葡萄幼果期含少量淀粉[10]，而其他发育时期几乎不含淀粉的结论为切入点[11]，首先通过对葡萄果实成熟过程中各阶段淀粉合成途径的ADP葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)以及淀粉降解途径关键酶淀粉水解酶(αAmylase和βAmylase)两种酶的活性进行测定，之后以模式植物拟南芥中淀粉代谢相关酶基因VvAPL、VvAPS、VvAMY1和VvBAM1的cDNA序列全长为探针，对葡萄基因组数据库进行BLAST比对，获得与拟南芥序列同源性最高的葡萄预测的CDS序列，利用实时荧光定量PCR技术，对这些基因进行表达分析与调控机理的研究。使人们进一步从分子水平上认识葡萄中淀粉代谢过程，对了解葡萄淀粉代谢调控机理，提高葡萄果实品质，具有重大意义。
1 材料与方法
1.1 研究材料
试材为种植于江苏省农业科学院果树种质圃适应性强、果粒大小均匀、糖分含量高的葡萄品种‘甬优1号’，于2012年5月中旬8月中旬即“甬优1号”一次果期进行分阶段采集样本。
采样当天进行及时处理，去籽，并将果肉果皮分离，分别用液氮迅速冷冻，于40℃保存备用。叶片做同样处理，作为实验对照。由此共得到12组幼果样品、6组果皮样品、6组果肉样品、18组叶片样品，共计42组样品，作为供试材料。
1.2 试验方法
1.2.1 淀粉代谢关键酶活性的测定
1.酶液制备：
称取果肉（皮）1 g或叶片0.5g，置于预冷的研钵中，加2 mL 预冷的0.1 molL1 柠檬酸溶液(pH5.6)和少量石英砂研磨，将匀浆移入10 mL 的离心管中，再分别用1 mL的0.1 molL1柠檬酸缓冲液(pH 5.6)冲洗2 次, 在3000r/min下离心10min，上清液转移入100ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为淀粉酶原液（酶液I）。吸取上述淀粉酶原液200μL，稀释至1mL，摇匀，即为淀粉酶稀释液（酶液II）。
2.AGPase酶(Adenosine diphosphateglucose pyrophosphoyrlase)活性测定
方法参照Zabawinski 等[13]，并略有改动。反应液组成：100 mmol/L HEPESNaOH (pH 7.4)，5 mmol/L MgCl2，1.2 mmol/LADPG，3 mmol/L焦磷酸钠，4 mmol/L DTT和酶液100 μL，共650 μL。37 ℃保温30 min后置于沸水30 s终止反应。反应完的溶液转移至离心管，12000 rpm 4℃离心10 min。取出部分上清液，与15μL 10mmol/L NADP混合，以反应液作参比在340 nm下比色。然后加入0.4U的磷酸葡萄糖变位酶和0.35 U的6磷酸葡萄糖脱氢酶，37℃保温lh，以重蒸水作参比，与A340下测定吸光值。两次比色测定值之差即为NADP的消耗量。
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