不结球白菜skp1基因的克隆及vigs功能验证
病毒诱导的基因沉默（virus induced gene silencing， VIGS），携带目的基因片段的病毒侵染植物，诱导植物内源目的基因沉默，进而有效研究目的基因的功能。本研究采用PCR技术从不结球白菜基因组中克隆了S期激酶相关蛋白1（S-phase kinase-associated protein1， SKP1）基因的序列。双酶切SKP1基因片段和烟草脆裂病毒载体（pTRV2），构建了重组载体pTRV2-SKP1，并将该重组载体转化农杆菌，使用叶片注射法侵染正常烟草植株。进行受侵染植株表型差异分析，验证SKP1基因在植株生长发育的作用，为今后SKP1基因的分子机理研究奠定基础。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 实验材料2
1.2 方法2
1.2.1 不结球白菜SKP1基因的克隆2
1.2.2 重组pTRV2SKP1载体构建3
1.2.3 农杆菌侵染及沉默植株获得3
1.2.4 RTPCR验证3
1.2.5 VIGS表型分析3
2 结果与分析3
2.1 不结球白菜SKP1基因片段克隆3
2.2 pTRV2SKP1重组载体构建及转化4
2.3 RTPCR验证4
2.4 VIGS表型分析5
3 讨论5
致谢6
参考文献6
不结球白菜SKP1基因的克隆及VIGS功能验证
引言
病毒诱导的基因沉默（virus induced gene silencing，VIGS），是指携带目的基因片段的病毒侵染植物后，可诱导植物内源目的基因mRNA序列特异性降解，导致沉默和表型变异，进而有效研究目的基因的功能[13]。VIGS技术具有方法简单、适用范围广以及获取结果迅速等优点，已成为研究功能基因组学以及特定基因功能的有效工具[4]。VIGS克服了传统转化方法所带来的诸多困难，能够鉴别当代植株特定基因功能缺失的表现型，直接靶定受关注的基因，使得具有特别意义的基因能够快速通 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
过VIGS载体测序和鉴定[5]。
VIGS是从研究转基因或寄主基因与病毒之间互相作用关系发展来的。它是将目的基因片段导入到病毒载体中，并用该病毒载体去侵染植物的组织细胞，此时组织细胞会自发识别入侵病毒的威胁，并且利用自身的防御机制来破坏病毒载体上所包含的外源基因，从而出现目标基因功能表达水平的下降甚至丧失，使得植株的表型发生突变，进而能够在较短的时间内通过研究植株的表型分析该基因的功能特性[6]。
S期激酶相关蛋白1（Sphase kinaseassociated protein1，SKP1）是真核生物中普遍存在的一类蛋白，通常与CDC53P/Cul1 Fbox形成SCF复合体参与泛素蛋白降解途径。能够调控细胞循环、生物节律、生物抗逆性以及雄性不育等许多重要过程[7]。如拟南芥AtSKP1基因在茎尖、花序、根的分生组织及叶原基和花原基等分裂旺盛的组织中呈现高水平表达，在这些分裂活性高的部位AtSKP1基因的mRNA高度累积，因此AtSKP1基因可能是植物细胞维持分裂活性所必不可少的[8]；另研究表明拟南芥中SKP1蛋白参与的SCF复合体在生长素响应途径中也起着重要作用[9]；西红柿的SKP1蛋白与尖孢镰刀霉菌的FRP1蛋白互作，FRP1蛋白对于该菌的致病性是非常重要的，所以SKP1蛋白对于西红柿抵抗枯萎病的发作至关重要[10]；大豆包囊线虫侵染大豆可诱导大豆SKP1基因的转录，SKP1可能参与大豆抵御线虫的侵染[11]；又SKP1基因与N基因介导的抗烟草花叶病毒（TMV）病相关[12]。植物SKP1基因在植物的生长及抗病性等方面都起着重要的作用，但该基因的具体作用机理尚不清楚[13]。
本实验以不结球白菜为材料，克隆了不结球白菜中SKP1基因的相关片段，构建携带SKP1基因的pTRV2重组病毒载体用于侵染烟草，验证SKP1基因在植株生长发育的作用，为今后研究SKP1基因功能的分子机理奠定基础。
1 材料与方法
1．1 实验材料
本试验的研究材料为不结球白菜，病毒载体pTRV1、pTRV2，农杆菌，大肠杆菌DH5α，由大学园艺学院白菜系统生物学实验室提供。
1．2 方法
1．2．1 不结球白菜SKP1基因的克隆 根据GenBank中已发表的烟草 SKP1基因的cDNA全长序列和pTRV2的特点，设计SKP1基因VIGS功能验证的上游引物skp1es （5’CGGCCCATATGTCCTCCTCAAAGATGATC3’）下游引物skp1ea （5’GCCGCCTCGAGCTCAAATGCCCAAGCATT3’），分别在skp1es和skp1ea的5c端引入了NdeI和XhoI酶切位点，去掉目的基因的终止密码子以产生融合有His标签的融合蛋白。
以不结球白菜cDNA为模板，skp1es和skp1ea为引物，扩增SKP1基因的开放读码框。反应体系50 μL，包含10×PCR Buffer 5 μL，dNTP Mix（2．5 mmol/L）4 μL，引物skp1es和skp1ea（10 μmol/L）各1μL，模板0．5 μL，LA Taq酶0．5μL，ddH2O 38 μL。反应条件为94℃预变性4 min，按94 ℃ 30 s，55 ℃ 30s，72 ℃ 1min进行30个循环，72 ℃延伸10 min。取PCR扩增产物5 μL，1％琼脂糖凝胶电泳检测，用DL 2000 Marker做参照，判断扩增产物的分子量大小，80 V电泳20 min放入成像仪中观察。
1．2．2 重组pTRV2SKP1载体构建 用百泰克公司琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，切胶回收PCR获得的目的基因片段。连接目的基因片段和T载体。把重组的质粒转化到大肠杆菌DH5α感受态中，涂板过夜，蓝白斑筛选，挑取白色菌落，即含有阳性重组子的菌落。
提取重组子中的质粒，用酶XhoI和酶NdeI对其双酶切，并进行对双酶切体系中的目的基因片段SKP1进行胶回收。同时用酶XhoI和酶NdeI把pTRV2双酶切。把经双酶切后的目的基因片段SKP1及pTRV2进行T4酶连接，转化大肠杆菌，经PCR鉴定以及酶XhoI和酶NdeI双酶切鉴定。
1．2．3 农杆菌侵染及沉默植株获得 将通过鉴定的重组质粒转入农杆菌（LBA4404） 中。分别取含pTRV1、pTRV2以及pTRV2SKP1的农杆菌各1 ml，分别接种于含有卡那霉素（50 μg/ml）、庆大霉素（50 μg/ml）和利福平（100 μg/ml）抗生素的20 ml YEB培养基中，置于28 ℃空气浴恒温振荡器中，200 r/min培养8～10 h。取出菌液，6000 r/min离心5 min，弃上清，收集菌体沉淀，用渗透液重新悬浮菌体，使菌液浓度达到OD600=1.0，将含有pTRV1载体的悬浮农杆菌液按1：1的比例分别与含pTRV2、pTRV2SKP1的农杆菌液混合。置于28 ℃空气浴恒温振荡器中，20 r/min培养3 h。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 实验材料2
1.2 方法2
1.2.1 不结球白菜SKP1基因的克隆2
1.2.2 重组pTRV2SKP1载体构建3
1.2.3 农杆菌侵染及沉默植株获得3
1.2.4 RTPCR验证3
1.2.5 VIGS表型分析3
2 结果与分析3
2.1 不结球白菜SKP1基因片段克隆3
2.2 pTRV2SKP1重组载体构建及转化4
2.3 RTPCR验证4
2.4 VIGS表型分析5
3 讨论5
致谢6
参考文献6
不结球白菜SKP1基因的克隆及VIGS功能验证
引言
病毒诱导的基因沉默（virus induced gene silencing，VIGS），是指携带目的基因片段的病毒侵染植物后，可诱导植物内源目的基因mRNA序列特异性降解，导致沉默和表型变异，进而有效研究目的基因的功能[13]。VIGS技术具有方法简单、适用范围广以及获取结果迅速等优点，已成为研究功能基因组学以及特定基因功能的有效工具[4]。VIGS克服了传统转化方法所带来的诸多困难，能够鉴别当代植株特定基因功能缺失的表现型，直接靶定受关注的基因，使得具有特别意义的基因能够快速通 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
过VIGS载体测序和鉴定[5]。
VIGS是从研究转基因或寄主基因与病毒之间互相作用关系发展来的。它是将目的基因片段导入到病毒载体中，并用该病毒载体去侵染植物的组织细胞，此时组织细胞会自发识别入侵病毒的威胁，并且利用自身的防御机制来破坏病毒载体上所包含的外源基因，从而出现目标基因功能表达水平的下降甚至丧失，使得植株的表型发生突变，进而能够在较短的时间内通过研究植株的表型分析该基因的功能特性[6]。
S期激酶相关蛋白1（Sphase kinaseassociated protein1，SKP1）是真核生物中普遍存在的一类蛋白，通常与CDC53P/Cul1 Fbox形成SCF复合体参与泛素蛋白降解途径。能够调控细胞循环、生物节律、生物抗逆性以及雄性不育等许多重要过程[7]。如拟南芥AtSKP1基因在茎尖、花序、根的分生组织及叶原基和花原基等分裂旺盛的组织中呈现高水平表达，在这些分裂活性高的部位AtSKP1基因的mRNA高度累积，因此AtSKP1基因可能是植物细胞维持分裂活性所必不可少的[8]；另研究表明拟南芥中SKP1蛋白参与的SCF复合体在生长素响应途径中也起着重要作用[9]；西红柿的SKP1蛋白与尖孢镰刀霉菌的FRP1蛋白互作，FRP1蛋白对于该菌的致病性是非常重要的，所以SKP1蛋白对于西红柿抵抗枯萎病的发作至关重要[10]；大豆包囊线虫侵染大豆可诱导大豆SKP1基因的转录，SKP1可能参与大豆抵御线虫的侵染[11]；又SKP1基因与N基因介导的抗烟草花叶病毒（TMV）病相关[12]。植物SKP1基因在植物的生长及抗病性等方面都起着重要的作用，但该基因的具体作用机理尚不清楚[13]。
本实验以不结球白菜为材料，克隆了不结球白菜中SKP1基因的相关片段，构建携带SKP1基因的pTRV2重组病毒载体用于侵染烟草，验证SKP1基因在植株生长发育的作用，为今后研究SKP1基因功能的分子机理奠定基础。
1 材料与方法
1．1 实验材料
本试验的研究材料为不结球白菜，病毒载体pTRV1、pTRV2，农杆菌，大肠杆菌DH5α，由大学园艺学院白菜系统生物学实验室提供。
1．2 方法
1．2．1 不结球白菜SKP1基因的克隆 根据GenBank中已发表的烟草 SKP1基因的cDNA全长序列和pTRV2的特点，设计SKP1基因VIGS功能验证的上游引物skp1es （5’CGGCCCATATGTCCTCCTCAAAGATGATC3’）下游引物skp1ea （5’GCCGCCTCGAGCTCAAATGCCCAAGCATT3’），分别在skp1es和skp1ea的5c端引入了NdeI和XhoI酶切位点，去掉目的基因的终止密码子以产生融合有His标签的融合蛋白。
以不结球白菜cDNA为模板，skp1es和skp1ea为引物，扩增SKP1基因的开放读码框。反应体系50 μL，包含10×PCR Buffer 5 μL，dNTP Mix（2．5 mmol/L）4 μL，引物skp1es和skp1ea（10 μmol/L）各1μL，模板0．5 μL，LA Taq酶0．5μL，ddH2O 38 μL。反应条件为94℃预变性4 min，按94 ℃ 30 s，55 ℃ 30s，72 ℃ 1min进行30个循环，72 ℃延伸10 min。取PCR扩增产物5 μL，1％琼脂糖凝胶电泳检测，用DL 2000 Marker做参照，判断扩增产物的分子量大小，80 V电泳20 min放入成像仪中观察。
1．2．2 重组pTRV2SKP1载体构建 用百泰克公司琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，切胶回收PCR获得的目的基因片段。连接目的基因片段和T载体。把重组的质粒转化到大肠杆菌DH5α感受态中，涂板过夜，蓝白斑筛选，挑取白色菌落，即含有阳性重组子的菌落。
提取重组子中的质粒，用酶XhoI和酶NdeI对其双酶切，并进行对双酶切体系中的目的基因片段SKP1进行胶回收。同时用酶XhoI和酶NdeI把pTRV2双酶切。把经双酶切后的目的基因片段SKP1及pTRV2进行T4酶连接，转化大肠杆菌，经PCR鉴定以及酶XhoI和酶NdeI双酶切鉴定。
1．2．3 农杆菌侵染及沉默植株获得 将通过鉴定的重组质粒转入农杆菌（LBA4404） 中。分别取含pTRV1、pTRV2以及pTRV2SKP1的农杆菌各1 ml，分别接种于含有卡那霉素（50 μg/ml）、庆大霉素（50 μg/ml）和利福平（100 μg/ml）抗生素的20 ml YEB培养基中，置于28 ℃空气浴恒温振荡器中，200 r/min培养8～10 h。取出菌液，6000 r/min离心5 min，弃上清，收集菌体沉淀，用渗透液重新悬浮菌体，使菌液浓度达到OD600=1.0，将含有pTRV1载体的悬浮农杆菌液按1：1的比例分别与含pTRV2、pTRV2SKP1的农杆菌液混合。置于28 ℃空气浴恒温振荡器中，20 r/min培养3 h。
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