梨pynac基因的克隆与表达特性的研究
摘要：为了明确PyNAC转录因子是否在果实生长发育过程中发挥重要作用，从而为梨果实大小性状的遗传改良提供基因资源。根据梨基因组注释及比对获得梨的NAC基因PyNAC，用荧光定量PCR的方法分析基因的表达情况，发现梨PyNAC基因在‘砀山酥梨’果实发育过程中的表达量较高，梨PyNAC基因的表达情况和果实的纵径、横径的变化特征存在着一定的联系，推测PyNAC可能与梨果实的纵径、横径有关。通过序列扩增法，成功克隆了梨的NAC基因PyNAC，并构建了其过量表达载体pCAMBIA1301-PyNAC，使用农杆菌介导的遗传转化方法转化模式植物Micro-Tom番茄，成功转化并得到再生株系。表达载体pCAMBIA1301-PyNAC的构建及再生植株的获得，为进一步探究梨PyNAC基因的功能奠定了基础。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1植物材料 2
1.2质粒 2
1.3各种培养基2
1.4 梨果肉组织RNA的提取2
1.5 RTqPCR 实验方法3
1.6 梨中PyNAC基因的克隆3
1.7 梨PyNAC转录因子的pCAMBIA1301表达载体构建3
1.8带有目的基因PyNAC番茄遗传转化方法3
2 结果与分析4
2.1 梨PyNAC基因的定量表达分析4
2.2 梨PyNAC基因的全长克隆6
2.3 表达载体pCAMBIA1301PyNAC构建7
2.4 含有目的基因的表达载体在番茄中的遗传转化9
3讨论 10
致谢10
参考文献11
图1 砀山酥梨果实样品动态图
图2 ‘砀山酥梨‘动态果实样品单果重、纵径及横径；横轴为采样日期，第一次采 样日期4月12日为花后20天，DAF为花后天数
图3 PyNAC基因在‘砀山酥梨’果实发育过程中的表达；DAF为花后天数
图4 梨PyNAC基因的扩增产物电泳图谱
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
图5 大肠杆菌阳性单克隆子菌液PCR检测电泳图
图6 PyNAC基因克隆测序结果序列比对图
图7 带有酶切位点的目的基因PCR检测
图8 梨PyNAC基因和pCAMBIA1301表达载体的双酶切电泳图
图9 PyNAC基因的pCAMBIA1301超表达载体的测序结果序列比对
图10 pCAMBIA1301PyNAC表达载体在农杆菌转化的PCR验证
图11 a MicroTom番茄无菌苗；b：pCAMBIA1301PyNAC表达载体浸染MicroTom番茄后的愈伤组织；c：pCAMBIA1301PyNAC表达载体在MicroTom番茄转化后的再生株系
梨PyNAC基因的克隆与表达特性的研究
引言
引言
梨果实大小是商品梨果实的重要外观品质之一，随着单果质量增大，果实可溶性总糖、可溶性固形物含量呈下降趋势，石细胞含量增加（Hayashi S, Tanabe K. 1991）。因此，梨果实大小是决定梨果实品质的重要因素。梨果实的大小与质量除了与栽培管理因素相关外，遗传因素是决定梨果实大小的决定性因素（Xie等，2000）。梨果实大小性状是多基因控制的，研究梨控制梨果实大小的关键基因能在分子和遗传水平改善梨果实品质，从而对梨产业发展产生积极地推动作用。
本研究拟克隆梨的NCA转录因子，通过研究其在果实发育过程中的表达特性，并构建表达载体进行转基因功能验证，从而明确NAC转录因子是否在果实生长发育过程中发挥重要作用，为梨果实大小性状的遗传改良提供基因资源。
1 材料与方法
1．1 植物材料
砀山酥梨的果实发育动态样品，采集于大学浦口区园艺试验站，花后20天开始采集样品，每隔20天采一次样品；MicroTom番茄种子购自南京丰硕园艺有限公司。
1．2 质粒
PMD19T载体（Takara公司提供），抗性为抗Amp；质粒pCAMBIA1301，为本实验使用的表达载体。pCAMBIA1301载体含有卡那霉素抗性基因，此特征可以用于阳性克隆的筛选；pCAMBIA1301质粒的T border（L）以及其对应的T border（R）之间的区域，是农杆菌浸染植物材料时能够进入植物细胞的TDNA区域，这个区域内有潮霉素抗性基因，可用于阳性植株或愈伤组织的筛选；pCAMBIA1301载体既可以在大肠杆菌中穿梭也可以进入农杆菌中自我复制，主要用于真核生物尤其是植物上的表达。
1．3 各种培养基
1．3．1农杆菌培养基（LB固体培养基）
0.25g酵母粉、0.5g胰蛋白、0.5g氯化钠、0.75g琼脂粉、50ml水。高压蒸汽灭菌20min,冷却至适宜温度加25ulKana(1/2000)、50ulRif(1/1000).
1．3．2 MS液体培养基(1L，PH=5.8)
50ml大量、50ml钙、10ml微量、10ml铁、10ml有机。
高压蒸汽灭菌20min，冷却后使用。
1．3．3萌发培养基(400ml，6瓶，)
10ml大量、4ml微量、20ml钙、4ml铁、4ml有机、3g琼脂粉、12g蔗糖、350ml水
1．3．4预培养基（150ml，PH=5.8）
7.5ml大量、1.5ml微量、7.5ml钙、1.5ml铁、1.5ml有机、1.2g琼脂粉、4.5g蔗糖，130ml水。150ulZT(高压蒸汽灭菌后，冷却后加)
1．3．5暗培养基(150ml,PH=5.8)
7.5ml大量、1.5ml微量、7.5ml钙、1.5ml铁、1.5ml有机、1.2g琼脂粉、4.5g蔗糖，130ml水。150ulZT、150ulAS(高压蒸汽灭菌后，冷却后加)
1．3．6筛选培养基(愈伤培养基)(1L,PH=5.8)
50ml大量、10ml微量、50ml钙、10ml铁、10ml有机、8g琼脂粉、30g蔗糖，870ml水。1mlZT、24mlcef(高压蒸汽灭菌后，冷却后加)
1．3．7生根培养基(1L，PH=5.8)
25ml大量、10ml微量、50ml钙、10ml铁、10ml有机、2mlIBA、7g琼脂粉、30g蔗糖，990ml水。24mlCef(高压蒸汽灭菌后，冷却后加)
1.4 梨果肉组织RNA提取
取少量梨果肉样品于液氮中研磨—加入提取液和β—巯基乙醇—水浴后离心取上清液—用等体积的氯仿异戊醇抽提2次—取上清液后加入LiCl沉淀10h—使用DNase消化DNA，详细方法参照鲁晓燕等（2004）。备注：实验操作中所用到的需要接触植物样品的试剂以及器材都需要用DEPC处理，以去除RNA酶，确保提取效率。
1.5 RTqPCR 实验方法
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1植物材料 2
1.2质粒 2
1.3各种培养基2
1.4 梨果肉组织RNA的提取2
1.5 RTqPCR 实验方法3
1.6 梨中PyNAC基因的克隆3
1.7 梨PyNAC转录因子的pCAMBIA1301表达载体构建3
1.8带有目的基因PyNAC番茄遗传转化方法3
2 结果与分析4
2.1 梨PyNAC基因的定量表达分析4
2.2 梨PyNAC基因的全长克隆6
2.3 表达载体pCAMBIA1301PyNAC构建7
2.4 含有目的基因的表达载体在番茄中的遗传转化9
3讨论 10
致谢10
参考文献11
图1 砀山酥梨果实样品动态图
图2 ‘砀山酥梨‘动态果实样品单果重、纵径及横径；横轴为采样日期，第一次采 样日期4月12日为花后20天，DAF为花后天数
图3 PyNAC基因在‘砀山酥梨’果实发育过程中的表达；DAF为花后天数
图4 梨PyNAC基因的扩增产物电泳图谱
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
图5 大肠杆菌阳性单克隆子菌液PCR检测电泳图
图6 PyNAC基因克隆测序结果序列比对图
图7 带有酶切位点的目的基因PCR检测
图8 梨PyNAC基因和pCAMBIA1301表达载体的双酶切电泳图
图9 PyNAC基因的pCAMBIA1301超表达载体的测序结果序列比对
图10 pCAMBIA1301PyNAC表达载体在农杆菌转化的PCR验证
图11 a MicroTom番茄无菌苗；b：pCAMBIA1301PyNAC表达载体浸染MicroTom番茄后的愈伤组织；c：pCAMBIA1301PyNAC表达载体在MicroTom番茄转化后的再生株系
梨PyNAC基因的克隆与表达特性的研究
引言
引言
梨果实大小是商品梨果实的重要外观品质之一，随着单果质量增大，果实可溶性总糖、可溶性固形物含量呈下降趋势，石细胞含量增加（Hayashi S, Tanabe K. 1991）。因此，梨果实大小是决定梨果实品质的重要因素。梨果实的大小与质量除了与栽培管理因素相关外，遗传因素是决定梨果实大小的决定性因素（Xie等，2000）。梨果实大小性状是多基因控制的，研究梨控制梨果实大小的关键基因能在分子和遗传水平改善梨果实品质，从而对梨产业发展产生积极地推动作用。
本研究拟克隆梨的NCA转录因子，通过研究其在果实发育过程中的表达特性，并构建表达载体进行转基因功能验证，从而明确NAC转录因子是否在果实生长发育过程中发挥重要作用，为梨果实大小性状的遗传改良提供基因资源。
1 材料与方法
1．1 植物材料
砀山酥梨的果实发育动态样品，采集于大学浦口区园艺试验站，花后20天开始采集样品，每隔20天采一次样品；MicroTom番茄种子购自南京丰硕园艺有限公司。
1．2 质粒
PMD19T载体（Takara公司提供），抗性为抗Amp；质粒pCAMBIA1301，为本实验使用的表达载体。pCAMBIA1301载体含有卡那霉素抗性基因，此特征可以用于阳性克隆的筛选；pCAMBIA1301质粒的T border（L）以及其对应的T border（R）之间的区域，是农杆菌浸染植物材料时能够进入植物细胞的TDNA区域，这个区域内有潮霉素抗性基因，可用于阳性植株或愈伤组织的筛选；pCAMBIA1301载体既可以在大肠杆菌中穿梭也可以进入农杆菌中自我复制，主要用于真核生物尤其是植物上的表达。
1．3 各种培养基
1．3．1农杆菌培养基（LB固体培养基）
0.25g酵母粉、0.5g胰蛋白、0.5g氯化钠、0.75g琼脂粉、50ml水。高压蒸汽灭菌20min,冷却至适宜温度加25ulKana(1/2000)、50ulRif(1/1000).
1．3．2 MS液体培养基(1L，PH=5.8)
50ml大量、50ml钙、10ml微量、10ml铁、10ml有机。
高压蒸汽灭菌20min，冷却后使用。
1．3．3萌发培养基(400ml，6瓶，)
10ml大量、4ml微量、20ml钙、4ml铁、4ml有机、3g琼脂粉、12g蔗糖、350ml水
1．3．4预培养基（150ml，PH=5.8）
7.5ml大量、1.5ml微量、7.5ml钙、1.5ml铁、1.5ml有机、1.2g琼脂粉、4.5g蔗糖，130ml水。150ulZT(高压蒸汽灭菌后，冷却后加)
1．3．5暗培养基(150ml,PH=5.8)
7.5ml大量、1.5ml微量、7.5ml钙、1.5ml铁、1.5ml有机、1.2g琼脂粉、4.5g蔗糖，130ml水。150ulZT、150ulAS(高压蒸汽灭菌后，冷却后加)
1．3．6筛选培养基(愈伤培养基)(1L,PH=5.8)
50ml大量、10ml微量、50ml钙、10ml铁、10ml有机、8g琼脂粉、30g蔗糖，870ml水。1mlZT、24mlcef(高压蒸汽灭菌后，冷却后加)
1．3．7生根培养基(1L，PH=5.8)
25ml大量、10ml微量、50ml钙、10ml铁、10ml有机、2mlIBA、7g琼脂粉、30g蔗糖，990ml水。24mlCef(高压蒸汽灭菌后，冷却后加)
1.4 梨果肉组织RNA提取
取少量梨果肉样品于液氮中研磨—加入提取液和β—巯基乙醇—水浴后离心取上清液—用等体积的氯仿异戊醇抽提2次—取上清液后加入LiCl沉淀10h—使用DNase消化DNA，详细方法参照鲁晓燕等（2004）。备注：实验操作中所用到的需要接触植物样品的试剂以及器材都需要用DEPC处理，以去除RNA酶，确保提取效率。
1.5 RTqPCR 实验方法
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