胡萝卜瓣化型细胞质雄性不育atp6基因的分离和功能分析(附件)
细胞质雄性不育（Cytoplasmic Male Sterility）是杂种优势利用的主要工具之一，另一方面，CMS系也是植物遗传学研究的基础材料，是当前研究的热点之一。大量科研已经显示CMS的发生和线粒体基因组的突变、重组或RNA编辑密切相关。目前生产上，胡萝卜杂种优势利用相对落后，而胡萝卜瓣化型CMS的产生及不育机理缺乏深入的研究和了解，很大程度阻碍了胡萝卜瓣化型CMS在实际育种中的充分利用。本文研究了胡萝卜瓣化型细胞质雄性不育相关的atp6基因与细胞质雄性不育的相关机理。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言4
1材料与方法5
1.1胡萝卜不育系和保持系实验材料的获取 5
1.2胡萝卜DNA的提取方法和步骤 5
1.2.1胡萝卜DNA提取试剂及其保存5
1.2.2胡萝卜DNA的提取步骤6
1.3胡萝卜atp6 基因克隆6
1.4目的片段的回收和克隆 6
1.4.1目的片段的回收和克隆所需试剂 6
1.4.2目的片段的回收和克隆实验步骤 6
1.5序列分析 7
2结果与分析7
2.1胡萝卜线粒体 atp6 基因的克隆和它的序列特征7
2.2胡萝卜atp6基因对应的氨基酸序列的理化性质分析 8
2.3胡萝卜atp6 基因编码蛋白的系统发生分析9
2.4胡萝卜不育系及胡萝卜保持系atp6蛋白序列跨膜区结构预测10
2.5胡萝卜不育系和胡萝卜保持系atp6蛋白进化树分析11
3结论与讨论 11
致谢12
参考文献12
胡萝卜瓣化型细胞质雄性不育atp6基因的分离和功能分析
引言
引言
胡萝卜（Daucus?carota?L.），学名叫做甘荀，属于伞形科植物，也属于胡萝卜属，是二年生的草本植物，是蔬菜的一种，肉质根可食用[1]。胡萝卜原产地是在亚洲板块的西南部，它最早发源、演化是从阿富汗开始的，到现在为止已经有两千多年的培育种植历史了。胡萝 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
卜属于异花授粉类型的作物，一代杂种胡萝卜在产量、品质、商品性状、抗病性和抗逆性等其他各方面都比普通品种的胡萝卜性能优越[2] 。胡萝卜的杂种优势在高代自交系之间相对较为明显[3]。杂种优势利用的一个很好的遗传特性就是胡萝卜的雄性不育。细胞质雄性不育这种现象在高等植物中普遍存在，它的表达现象是小孢子的发育相对异常、不能产出花粉或者花粉败育，不过卵细胞能够发育正常、能够接受其他花粉并正常长出果实，是杂种优势利用中应用最广泛的一种类型[3] [8]。
但由于胡萝卜人工去雄相对比较困难，并且花器很小，而雄性不育机制研究尚不清楚，缺少大量生产杂种种子的系统，我们对于胡萝卜杂种优势的利用相对落后于其它蔬菜作物[4]。“褐药型”（简称ba型）胡萝卜雄性不育株的表征为：它的花瓣比较整齐，但花瓣展开的程度比较小，花药在花瓣打开之前就萎缩了，颜色相对比较暗，开花后它的花丝难以伸展变长，在雄蕊的子房四周附着着花药，花药萎缩然后就会变成黄褐色[5]。一九六一年Thompson第一次在野外无意间观察并注意到了“瓣化型”（简称Pt型）胡萝卜，是雄性不育的野生胡萝卜，其表现为花药转化成难以生产并产生功能性花粉的花瓣或者说相似花瓣的结构单元，雄蕊的畸变程度不完全一样[6]。伴随着胡萝卜雄性不育遗传以及胡萝卜生物学特性等科学领域进行的深入研究，各国在选育胡萝卜雄性不育系，以及利用胡萝卜不育系等领域均获得一定程度的进展[6]。到目前为止，基本上全部的发达国家都在研究胡萝卜的育种及其相关联的工作，而且研究方向不断改善，由刚开始单纯的系统选育转向以杂交育种为主的选育工作，胡萝卜雄性不育选择育种以及相关应用的科研探索在迅猛发展。研究表明，胡萝卜“瓣化型”不育系是一种遗传相对多样化、多元化的系统，方便研究人员观察和探索[7]。
细胞质雄性不育这种现象在高等植物中普遍存在，它的表达现象是小孢子的发育相对异常、不能产出花粉或者花粉败育，不过卵细胞能够发育正常、能够接受其他花粉并正常长出果实，是杂种优势利用中应用最广泛的一种类型[3] [8]。它遗传的方式不受孟德尔法则控制而呈母系遗传[9]。CMS 主要是由细胞质中的遗传物质控制的，但众所周知，细胞核控制着细胞质中的绝大部分的生理生化反应，因此，细胞质雄性不育一般指的是：植物的细胞核及其细胞质它们共同作用的结果。科研工作者相继在植物亚麻、玉米和小麦等作物中也发现了细胞质雄性不育的存在，到现在为止，细胞质雄性不育已在150种植物中报道[10]。细胞质雄性不育不但在利用植物杂种优势这一领域有着不可替代的作用，并且在遗传学实验研究领域充当着优质的实验材料。
虽然植物的雄性不育对它自身来讲不是一个有利性状，但是在实验研究当中，它却是杂种优势利用的一个理想遗传特性[11]。研究关于植物细胞质雄性不育的相关机理，一直是国内外生物学科学研究的热点项目，并获得了重大突破。科研结果显示：植物的线粒体与其细胞质雄性不育之间有着非常紧密的关联。由于线粒体是能量代谢的主要细胞器之一，线粒体的结构和它的数量有很大概率和CMS有关[11]。因为存在许多重复的基因序列在植物线粒体基因组内，所以当某些功能基因位于重复的基因序列边缘时，就可能在发生在重组的过程中受到影响，并导致基因结构的变化和功能改变,这些基因结构和功能的改变会导致CMS的发生[12]。另外，同细胞核基因的表达一样，线粒体基因的表达调控也是一个及其复杂的过程，一方面当线粒体基因组DNA发生过度重排后，基因的转录就会产生多个转录起始位点和终止位点，因此一个基因可能会产生多个RNA分子，或者多个基因共转录形成单个的多顺反子[13]。另一方面，线粒体基因组中存在内含子，初级转录物在成熟过程中会发生剪接和RNA编辑等加工方式，这些都有可能导致CMS的发生[14]。
到目前为止，科研人员对于CMS相关基因的了解程度比较有限，对其他细胞质雄性不育特异性序列的起源更是知之甚少[15]。
目前国内国外对胡萝卜atp6基因与胡萝卜瓣化型CMS的科学探究比较少，不过进行过类似基因例如atp9基因的实验研究[16]。为了分离然后克隆出胡萝卜线粒体中CMS有关的基因片段，科研工作者用胡萝卜atp9基因序列来设计引物 ,然后用半定量技术探究了atp9基因在胡萝卜不育系与其保持系中的基因表达状况[16]。结果表明:atp9基因相比于胡萝卜保持系，它在不育系之中出现了少数碱基的缺失和置换；通过基因表达的量化分析不难得出：胡萝卜不育系atp9基因在胡萝卜花蕾期发育时期的前3个时间段，它基因的表达程度相对偏低,与此同时，它在在大花蕾期明显比保持系要高,不过在盛花时期却低于保持系的表达量 [16]。由此推理可得，胡萝卜atp9基因的结构变异与异常表达和胡萝卜CMS联系紧密[16]。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言4
1材料与方法5
1.1胡萝卜不育系和保持系实验材料的获取 5
1.2胡萝卜DNA的提取方法和步骤 5
1.2.1胡萝卜DNA提取试剂及其保存5
1.2.2胡萝卜DNA的提取步骤6
1.3胡萝卜atp6 基因克隆6
1.4目的片段的回收和克隆 6
1.4.1目的片段的回收和克隆所需试剂 6
1.4.2目的片段的回收和克隆实验步骤 6
1.5序列分析 7
2结果与分析7
2.1胡萝卜线粒体 atp6 基因的克隆和它的序列特征7
2.2胡萝卜atp6基因对应的氨基酸序列的理化性质分析 8
2.3胡萝卜atp6 基因编码蛋白的系统发生分析9
2.4胡萝卜不育系及胡萝卜保持系atp6蛋白序列跨膜区结构预测10
2.5胡萝卜不育系和胡萝卜保持系atp6蛋白进化树分析11
3结论与讨论 11
致谢12
参考文献12
胡萝卜瓣化型细胞质雄性不育atp6基因的分离和功能分析
引言
引言
胡萝卜（Daucus?carota?L.），学名叫做甘荀，属于伞形科植物，也属于胡萝卜属，是二年生的草本植物，是蔬菜的一种，肉质根可食用[1]。胡萝卜原产地是在亚洲板块的西南部，它最早发源、演化是从阿富汗开始的，到现在为止已经有两千多年的培育种植历史了。胡萝 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
卜属于异花授粉类型的作物，一代杂种胡萝卜在产量、品质、商品性状、抗病性和抗逆性等其他各方面都比普通品种的胡萝卜性能优越[2] 。胡萝卜的杂种优势在高代自交系之间相对较为明显[3]。杂种优势利用的一个很好的遗传特性就是胡萝卜的雄性不育。细胞质雄性不育这种现象在高等植物中普遍存在，它的表达现象是小孢子的发育相对异常、不能产出花粉或者花粉败育，不过卵细胞能够发育正常、能够接受其他花粉并正常长出果实，是杂种优势利用中应用最广泛的一种类型[3] [8]。
但由于胡萝卜人工去雄相对比较困难，并且花器很小，而雄性不育机制研究尚不清楚，缺少大量生产杂种种子的系统，我们对于胡萝卜杂种优势的利用相对落后于其它蔬菜作物[4]。“褐药型”（简称ba型）胡萝卜雄性不育株的表征为：它的花瓣比较整齐，但花瓣展开的程度比较小，花药在花瓣打开之前就萎缩了，颜色相对比较暗，开花后它的花丝难以伸展变长，在雄蕊的子房四周附着着花药，花药萎缩然后就会变成黄褐色[5]。一九六一年Thompson第一次在野外无意间观察并注意到了“瓣化型”（简称Pt型）胡萝卜，是雄性不育的野生胡萝卜，其表现为花药转化成难以生产并产生功能性花粉的花瓣或者说相似花瓣的结构单元，雄蕊的畸变程度不完全一样[6]。伴随着胡萝卜雄性不育遗传以及胡萝卜生物学特性等科学领域进行的深入研究，各国在选育胡萝卜雄性不育系，以及利用胡萝卜不育系等领域均获得一定程度的进展[6]。到目前为止，基本上全部的发达国家都在研究胡萝卜的育种及其相关联的工作，而且研究方向不断改善，由刚开始单纯的系统选育转向以杂交育种为主的选育工作，胡萝卜雄性不育选择育种以及相关应用的科研探索在迅猛发展。研究表明，胡萝卜“瓣化型”不育系是一种遗传相对多样化、多元化的系统，方便研究人员观察和探索[7]。
细胞质雄性不育这种现象在高等植物中普遍存在，它的表达现象是小孢子的发育相对异常、不能产出花粉或者花粉败育，不过卵细胞能够发育正常、能够接受其他花粉并正常长出果实，是杂种优势利用中应用最广泛的一种类型[3] [8]。它遗传的方式不受孟德尔法则控制而呈母系遗传[9]。CMS 主要是由细胞质中的遗传物质控制的，但众所周知，细胞核控制着细胞质中的绝大部分的生理生化反应，因此，细胞质雄性不育一般指的是：植物的细胞核及其细胞质它们共同作用的结果。科研工作者相继在植物亚麻、玉米和小麦等作物中也发现了细胞质雄性不育的存在，到现在为止，细胞质雄性不育已在150种植物中报道[10]。细胞质雄性不育不但在利用植物杂种优势这一领域有着不可替代的作用，并且在遗传学实验研究领域充当着优质的实验材料。
虽然植物的雄性不育对它自身来讲不是一个有利性状，但是在实验研究当中，它却是杂种优势利用的一个理想遗传特性[11]。研究关于植物细胞质雄性不育的相关机理，一直是国内外生物学科学研究的热点项目，并获得了重大突破。科研结果显示：植物的线粒体与其细胞质雄性不育之间有着非常紧密的关联。由于线粒体是能量代谢的主要细胞器之一，线粒体的结构和它的数量有很大概率和CMS有关[11]。因为存在许多重复的基因序列在植物线粒体基因组内，所以当某些功能基因位于重复的基因序列边缘时，就可能在发生在重组的过程中受到影响，并导致基因结构的变化和功能改变,这些基因结构和功能的改变会导致CMS的发生[12]。另外，同细胞核基因的表达一样，线粒体基因的表达调控也是一个及其复杂的过程，一方面当线粒体基因组DNA发生过度重排后，基因的转录就会产生多个转录起始位点和终止位点，因此一个基因可能会产生多个RNA分子，或者多个基因共转录形成单个的多顺反子[13]。另一方面，线粒体基因组中存在内含子，初级转录物在成熟过程中会发生剪接和RNA编辑等加工方式，这些都有可能导致CMS的发生[14]。
到目前为止，科研人员对于CMS相关基因的了解程度比较有限，对其他细胞质雄性不育特异性序列的起源更是知之甚少[15]。
目前国内国外对胡萝卜atp6基因与胡萝卜瓣化型CMS的科学探究比较少，不过进行过类似基因例如atp9基因的实验研究[16]。为了分离然后克隆出胡萝卜线粒体中CMS有关的基因片段，科研工作者用胡萝卜atp9基因序列来设计引物 ,然后用半定量技术探究了atp9基因在胡萝卜不育系与其保持系中的基因表达状况[16]。结果表明:atp9基因相比于胡萝卜保持系，它在不育系之中出现了少数碱基的缺失和置换；通过基因表达的量化分析不难得出：胡萝卜不育系atp9基因在胡萝卜花蕾期发育时期的前3个时间段，它基因的表达程度相对偏低,与此同时，它在在大花蕾期明显比保持系要高,不过在盛花时期却低于保持系的表达量 [16]。由此推理可得，胡萝卜atp9基因的结构变异与异常表达和胡萝卜CMS联系紧密[16]。
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