应用酵母双杂交系统验证bbx24互作蛋白
摘要：【目的】BBX24转录因子参与调控菊花花期及非生物胁迫。本研究应用酵母双杂交系统验证CmBBX24互作蛋白，为研究互作蛋白在植物体花期及抗逆的调控机制奠定基础。【方法】从‘神马’花芽分化文库中筛选到可能与CmBBX24互作的蛋白CmBBX28和CmBBX29，提取其叶片总RNA，通过RT-PCR和RACE-PCR克隆基因CmBBX28和CmBBX29；在此基础上双酶切构建载体pGADT7-CmBBX28和pGADT7-CmBBX29；最后应用酵母双杂交系统验证CmBBX24与CmBBX28和CmBBX29是否存在互作。【结果】克隆获得CmBBX28基因全长1029bp，其开放阅读框552bp；CmBBX29基因全长890bp，其开放阅读框591bp。菌落PCR鉴定，载体pGADT7-CmBBX28和pGADT7-CmBBX29均构建完成。互作验证表明，菊花CmBBX24与CmBBX28和CmBBX29均发生相互作用。【结论】 酵母双杂交结果表明CmBBX28及CmBBX29可能参与调控开花时间及响应非生物胁迫过程，为CmBBX28及CmBBX29转基因菊花的功能分析，以及菊花花期和抗逆育种提供理论依据。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract. 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1.1 植物材料 2
1.2 菌株、质粒、试剂以及仪器 2
1.2.1 菌株、质粒、试剂 2
1.2.2 常用培养基 3
1.2.3 仪器设备 3
1.3 PCR引物序列 3
1.4 方法 4
1.4.1 克隆基因CmBBX28和CmBBX29 4
1.4.2 猎物载体的构建 7
1.4.3 酵母的转化 8
1.4.4 酵母双杂交并验证 9
2 结果与分析 9
2.1 基因的克隆 9
2.1.1 3RACE结果 9
2.1.2 5RACE结果 9
2.1.3 cDNA全长序列PCR 9
2.2 猎物载体的构建 10
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥3^5`1^9`1^6^0`7^2$
2.2.1 LA Taq PCR加酶切位点 10
2.2.2 双酶切结果 10
2.2.3 重组质粒的菌落PCR鉴定 11
2.3 酵母双杂交结果 11
3 讨论 14
3.1 RACEPCR结果分析 14
3.2双酶切构建载体的高效性 14
3.3筛选观赏植物菊花互作蛋白的重要性 14
致谢 15
参考文献 15
附录 18
附录A：基因序列 18
应用酵母双杂交系统验证BBX24互作蛋白
引言
【研究意义】转录因子是能与靶基因的启动子序列专一性结合，从而保证靶基因在特定的时间与空间以特定的强度表达的一类DNA结合蛋白[1]。BBX蛋白是一组锌指转录因子，是植物中相对较大的一类转录因子家族[2]。BBX蛋白在植物生长发育调控过程中起着关键调节作用，可参与调节植物幼苗的光形态建成、植物开花的花期调控、生物及非生物胁迫等过程[3]。在拟南芥中，BBox家族包含32个蛋白成员[4]。拟南芥超表达BBX24（STO）能够促使其在长日照和短日照下均提早开花，而敲除BBX24（STO）仅能够在短日照条件下延迟野生型开花。BBX24除了与开花时间有关外，还与植物的抗性有关[5]。研究表明，CmBBX24至少具有两个功能：一是调控开花时间和非生物胁迫抗性，二是影响赤霉素的生物合成[6]。运用酵母双杂交系统验证BBX24互作蛋白，可为CmBBX24及互作蛋白转基因菊花功能的分析奠定基础，从而推进菊花优异基因资源的发掘，为菊花花期及抗逆新品种的培育以及分子设计育种提供重要的理论依据。【前人研究进展】酵母双杂交系统（Yeast TwoHybrid System），又称相互作用陷阱（Interaction Trap），是由Fields[7]提出并创立的一种直接在酵母体内检测蛋白互作的遗传学方法，其不仅可以从cDNA文库中筛选与已知蛋白互作的未知蛋白，而且还可以非常灵敏地验证蛋白间的相互作用[8]。迄今，已成功用于拟南芥[911]、小麦[12]、油菜[13]、水稻[14]及甘蓝[15]等作物筛选互作蛋白及优异基因发掘等研究。在菊花方面，大量研究表明ICE1蛋白可进行转录后的翻译修饰，陈煜[16]等为了深入研究Cd1CE1的调控机理，以pGBKT7Cd1CE185为诱饵质粒，应用酵母双杂交体系筛选了Cd1CE1的互作蛋白，共筛选出64个阳性克隆，测序分析后，得到了与翻译修饰、氧化胁迫和光合作用相关的候选蛋白，揭示了Cd1CE1在信号转导及抗逆调控中的重要作用。楼望淮等[17]构建了pGBKT7CVBCP、pGADT7CmeIF4E和pGADT7CmeIF（iso4E）等酵母表达载体，应用酵母双杂交体系验证了CmeIF（iso）4E与CVBCP互作。之后，楼望淮[18]根据已报道植物的eIF4E序列设计特异性引物，采用RTPCR和RACEPCR克隆菊花翻译起始因子CmeIF4E基因，并通过酵母双杂交体系筛选到了CmeIF4E及其异构体CmeIF（iso）4E的互作蛋白。候选蛋白分析证明了CmeIF4E具有翻译起始作用，并推测其可能还与光合作用及植物的抗逆相关，为进一步研究该蛋白在菊花中的作用奠定了理论基础。孙静[19]以pGBKT7CmFTL3为诱饵质粒，应用酵母双杂交系统筛选得到5个与CmFTL3发生互作的蛋白，功能预测表明这5个蛋白可能介入了CmFTL3在细胞间/中的传递和运输。【本研究切入点】本研究以切花大菊‘神马’为研究对象，首先从‘神马’花芽分化文库中筛选到可能与CmBBX24互作的蛋白CmBBX28和CmBBX29；提取‘神马’叶片总RNA，通过RTPCR、3RACE和5RACE扩增克隆基因，得到CmBBX28和CmBBX29的全长；在此基础上双酶切构建载体pGADT7CmBBX28和pGADT7CmBBX29；最后应用酵母双杂交系统验证CmBBX24与CmBBX28和CmBBX29是否存在蛋白间的互作。【拟解决的关键问题】应用酵母双杂交系统验证BBX24的互作蛋白，为进一步研究CmBBX24互作蛋白在植物体内的花期及抗逆的调控机制奠定基础，为CmBBX24及互作蛋白转基因菊花功能的分析提供理论依据，从而推进菊花花期及抗逆新品种的培育。
1 材料与方法
1.1 植物材料
本研究所用植物材料切花大菊‘神马’保存于大学“中国菊花种质资源保存中心”。
1.2 菌株、质粒、试剂以及仪器
1.2.1 菌株、质粒、试剂
酵母菌株Y2H、大肠杆菌DH5α感受态细胞等均由本实验室保存。酵母培养试剂，酵母表达载体pGADT7和pGBKT7均由Clontech公司提供；其中钓饵载体pGBKT7CmBBX24N已由实验室刘亚男师姐构建完成。载体pMD19T及限制性内切酶BamH I、EcoR I、Nde I，高保真酶，T4 DNA连接酶等各类工具酶均由TaKaRa公司和Invitrogen公司提供。XαGal等购自Clontech公司；无氨基酵母氮源、琼脂糖等由Difco公司提供；化学试剂由Sigma公司提供；测序服务由华大基因公司提供。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract. 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1.1 植物材料 2
1.2 菌株、质粒、试剂以及仪器 2
1.2.1 菌株、质粒、试剂 2
1.2.2 常用培养基 3
1.2.3 仪器设备 3
1.3 PCR引物序列 3
1.4 方法 4
1.4.1 克隆基因CmBBX28和CmBBX29 4
1.4.2 猎物载体的构建 7
1.4.3 酵母的转化 8
1.4.4 酵母双杂交并验证 9
2 结果与分析 9
2.1 基因的克隆 9
2.1.1 3RACE结果 9
2.1.2 5RACE结果 9
2.1.3 cDNA全长序列PCR 9
2.2 猎物载体的构建 10
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥3^5`1^9`1^6^0`7^2$
2.2.1 LA Taq PCR加酶切位点 10
2.2.2 双酶切结果 10
2.2.3 重组质粒的菌落PCR鉴定 11
2.3 酵母双杂交结果 11
3 讨论 14
3.1 RACEPCR结果分析 14
3.2双酶切构建载体的高效性 14
3.3筛选观赏植物菊花互作蛋白的重要性 14
致谢 15
参考文献 15
附录 18
附录A：基因序列 18
应用酵母双杂交系统验证BBX24互作蛋白
引言
【研究意义】转录因子是能与靶基因的启动子序列专一性结合，从而保证靶基因在特定的时间与空间以特定的强度表达的一类DNA结合蛋白[1]。BBX蛋白是一组锌指转录因子，是植物中相对较大的一类转录因子家族[2]。BBX蛋白在植物生长发育调控过程中起着关键调节作用，可参与调节植物幼苗的光形态建成、植物开花的花期调控、生物及非生物胁迫等过程[3]。在拟南芥中，BBox家族包含32个蛋白成员[4]。拟南芥超表达BBX24（STO）能够促使其在长日照和短日照下均提早开花，而敲除BBX24（STO）仅能够在短日照条件下延迟野生型开花。BBX24除了与开花时间有关外，还与植物的抗性有关[5]。研究表明，CmBBX24至少具有两个功能：一是调控开花时间和非生物胁迫抗性，二是影响赤霉素的生物合成[6]。运用酵母双杂交系统验证BBX24互作蛋白，可为CmBBX24及互作蛋白转基因菊花功能的分析奠定基础，从而推进菊花优异基因资源的发掘，为菊花花期及抗逆新品种的培育以及分子设计育种提供重要的理论依据。【前人研究进展】酵母双杂交系统（Yeast TwoHybrid System），又称相互作用陷阱（Interaction Trap），是由Fields[7]提出并创立的一种直接在酵母体内检测蛋白互作的遗传学方法，其不仅可以从cDNA文库中筛选与已知蛋白互作的未知蛋白，而且还可以非常灵敏地验证蛋白间的相互作用[8]。迄今，已成功用于拟南芥[911]、小麦[12]、油菜[13]、水稻[14]及甘蓝[15]等作物筛选互作蛋白及优异基因发掘等研究。在菊花方面，大量研究表明ICE1蛋白可进行转录后的翻译修饰，陈煜[16]等为了深入研究Cd1CE1的调控机理，以pGBKT7Cd1CE185为诱饵质粒，应用酵母双杂交体系筛选了Cd1CE1的互作蛋白，共筛选出64个阳性克隆，测序分析后，得到了与翻译修饰、氧化胁迫和光合作用相关的候选蛋白，揭示了Cd1CE1在信号转导及抗逆调控中的重要作用。楼望淮等[17]构建了pGBKT7CVBCP、pGADT7CmeIF4E和pGADT7CmeIF（iso4E）等酵母表达载体，应用酵母双杂交体系验证了CmeIF（iso）4E与CVBCP互作。之后，楼望淮[18]根据已报道植物的eIF4E序列设计特异性引物，采用RTPCR和RACEPCR克隆菊花翻译起始因子CmeIF4E基因，并通过酵母双杂交体系筛选到了CmeIF4E及其异构体CmeIF（iso）4E的互作蛋白。候选蛋白分析证明了CmeIF4E具有翻译起始作用，并推测其可能还与光合作用及植物的抗逆相关，为进一步研究该蛋白在菊花中的作用奠定了理论基础。孙静[19]以pGBKT7CmFTL3为诱饵质粒，应用酵母双杂交系统筛选得到5个与CmFTL3发生互作的蛋白，功能预测表明这5个蛋白可能介入了CmFTL3在细胞间/中的传递和运输。【本研究切入点】本研究以切花大菊‘神马’为研究对象，首先从‘神马’花芽分化文库中筛选到可能与CmBBX24互作的蛋白CmBBX28和CmBBX29；提取‘神马’叶片总RNA，通过RTPCR、3RACE和5RACE扩增克隆基因，得到CmBBX28和CmBBX29的全长；在此基础上双酶切构建载体pGADT7CmBBX28和pGADT7CmBBX29；最后应用酵母双杂交系统验证CmBBX24与CmBBX28和CmBBX29是否存在蛋白间的互作。【拟解决的关键问题】应用酵母双杂交系统验证BBX24的互作蛋白，为进一步研究CmBBX24互作蛋白在植物体内的花期及抗逆的调控机制奠定基础，为CmBBX24及互作蛋白转基因菊花功能的分析提供理论依据，从而推进菊花花期及抗逆新品种的培育。
1 材料与方法
1.1 植物材料
本研究所用植物材料切花大菊‘神马’保存于大学“中国菊花种质资源保存中心”。
1.2 菌株、质粒、试剂以及仪器
1.2.1 菌株、质粒、试剂
酵母菌株Y2H、大肠杆菌DH5α感受态细胞等均由本实验室保存。酵母培养试剂，酵母表达载体pGADT7和pGBKT7均由Clontech公司提供；其中钓饵载体pGBKT7CmBBX24N已由实验室刘亚男师姐构建完成。载体pMD19T及限制性内切酶BamH I、EcoR I、Nde I，高保真酶，T4 DNA连接酶等各类工具酶均由TaKaRa公司和Invitrogen公司提供。XαGal等购自Clontech公司；无氨基酵母氮源、琼脂糖等由Difco公司提供；化学试剂由Sigma公司提供；测序服务由华大基因公司提供。
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