mir156介导spl调控葡萄果实发育成熟的分子机制
摘要：本实验利用半定量PCR技术分析不同的miR156及其靶基因SPL家族成员在葡萄果实发育成熟过程中的时空表达模式，结合对其相关性分析，初步鉴定miR156及其靶基因SPL家族参与葡萄果实发育成熟过程的重要成员。利用ABA、NAA处理，分析重要成员在处理与对照果实中表达差异，验证miR156与SPL家族中参与葡萄果实发育成熟的重要成员。结果显示：12个具有miR156靶位点的SPL转录因子家族成员中：VvSPL8、VvSPL10、VvSPL13、VvSPL15、VvSPL16、VvSPL18在葡萄果实发育过程中具有一定的表达。miR156随果实发育成熟表达量逐渐升高，ABA、NAA处理从两方面验证了miR156可能正调控葡萄果实成熟过程。实验的完成有助于从表观遗传学角度认识葡萄果实发育成熟的调控机理，为有效利用重要基因调控葡萄果实发育成熟过程提供理论依据。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1．1 材料 2
1．1．1 葡萄材料 2
1．1．2 主要仪器设备 2
1．2 方法 2
1．2．1 总RNA的提取 2
1．2．2 总RNA中DNA的消化 3
1．2．3 使用琼脂糖凝胶电泳检测总RNA完整性 3
1．2．4 点样及电泳: 3
1．2．5 MMLV试剂盒反转录 3
1．2．6 cDNA完整性及纯度检测 3
1．2．7 引物设计 4
1．2．8 半定量RTPCR 4
2 结果与分析 4
2．1 葡萄SPL转录因子与miR156家族的序列的BLAST比对分析 4
2．2 RNA提取及分析 5
2．2．1 RNA质量检测与完整性鉴定 5
2．2．2 RNA的OD值分析 5
2.3 cDNA浓度标定与稀释倍数确定 5
2．4 miR156及其靶基因SPL的半定量RTPCR表达分析 6
2.4.1 miR1
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
56在葡萄果实发育成熟过程中的表达分析 6
2.4.2具有miR156靶点的SPL家族成员在葡萄果实发育成熟过程中的表达分析 6
3 讨论 7
致谢 8
参考文献 8
miR156介导SPL调控葡萄果实发育成熟的分子机制
引言
在葡萄中，19条葡萄SPL成员中有12条SPL转录因子具有miR156的靶位点，表明miR156可能调控这12条SPL基因的表达。侯鸿敏尽管在野生葡萄方面曾做过SPB家族的时空表达分析[]，但鲜食葡萄方面尚无系统研究，本实验室前期曾克隆了葡萄SPL（VvSPL9和VvSPL10）转录因子，并发现它们在葡萄不同组织的表达具有显著的时空特异性，它们在葡萄幼果中均有较高水平的表达，随着果实的发育成熟其表达水平逐渐下降甚至消失，表明这些转录因子可能参与葡萄果实发育成熟的调控[,]。为此，本文分析了miR156家族及其靶基因SPL家族的不同成员在葡萄果实成熟过程的时空表达图谱，并利用ABA、NAA处理验证miR156与SPL家族成员在葡萄果实成熟过程的作用，初步鉴定了SPL家族中参与果实成熟过程中的重要成员。本实验的完成有助于从分子水平认识葡萄果实发育成熟的调控机理，为有效利用基因调控葡萄果实发育成熟过程提供理论依据，同时也为其它果树果实成熟的分子调控机制的研究提供重要参考。
1 材料与方法
材料
1．1．1 葡萄材料
基于前期研究基础及开展相关研究工作的需要，本研究拟以江苏省农科院葡萄实验基地的‘巨玫瑰’葡萄为研究试材。依据生产经验结合品种特性，选择葡萄果实发育的七个典型时期（幼果期、幼果膨大期、硬核期、第二次膨大期、转色期、转色中期、成熟期），随机从9株葡萄27个果穗上采集果实样品用于构建转录组文库。
试验材料作如下处理：ABA处理：在转色前1周，选择6穗长势相对一致的果穗，其中3穗用50mg/kg ABA涂抹，另3穗以清水处理作为对照；NAA处理：在转色前1周，与ABA处理相似，也选择6穗果实，其中3穗用200mg/kg NAA涂抹处理，另3穗用清水处理作为对照；对上述两种处理及相应的对照分别在转色期、转色后15天、成熟期动态采集果实样品。
样品采集保证每次从不同果穗的多个不同部位采取，以保证样品的代表性，采集后样品放入液氮速冻，带回实验室70℃保存备用。
1．1．2 主要仪器设备
冷冻离心机；超净工作台；PCR 仪；紫外凝胶成像系统；常温离心机。
1．2 方法
1．2．1 总RNA的提取
葡萄果实总RNA的提取参照张彦苹的SDS方法进行[]，具体步骤如下：
（1）在2ml离心管中样品研磨后加入65℃预热的800μl山梨醇中和50μl β巯基乙醇，混匀，静置5min，8000r/min，5min后取沉淀加入SDS 1100μl，β巯基乙醇55μl。
（2）在65℃水浴锅中放置30min（每隔10min，上下颠倒混匀），在冰盒中冷却，加入氯仿850μl，涡旋混匀后静置5min，离心机12000r/min离心20min；
（3）取1000μl上清液至2ml离心管中，加入1/2体积酚酸，涡旋，冰盒内静置5min，加入1/2体积氯仿（上清：酚酸：氯仿=2:1:1），涡旋混匀后静置2min，离心机12500r/min离心18min；
（4）将离心后的上清液转移到新的1.5ml的离心管中，加入和1/20体积的醋酸钠与1/10体积的无水乙醇，20℃冰箱静置40min；
（5）离心机预冷至4℃， 12500r/min离心18min，转移上清液到新的1.5ml的离心管中（约600μl），加入等体积异丙醇（约600μl），颠倒混匀后放置20℃冰箱中静置56h；
（7）离心机预冷至4℃，样品置入离心机12500r/min离心20min。弃上清，用75%的乙醇（750μl无水乙醇+250μl DEPC水）溶解沉淀，置于4℃，12500r/min离心6min，弃上清，加入750μl无水乙醇，再次4℃，12500r/min离心6min，弃上清，超净工作台上干燥10min，加入35μl经DEPC处理的ddH2O溶解沉淀，40℃保存备用。
1．2．2 总RNA中DNA的消化
为了消除RNA中的DNA，对样品的总RNA进行了 DNA消化。具体消化程序如下:
取大约取40μg总RNA，建立如下DNA消化体系：
表1 DNA消化体系
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1．1 材料 2
1．1．1 葡萄材料 2
1．1．2 主要仪器设备 2
1．2 方法 2
1．2．1 总RNA的提取 2
1．2．2 总RNA中DNA的消化 3
1．2．3 使用琼脂糖凝胶电泳检测总RNA完整性 3
1．2．4 点样及电泳: 3
1．2．5 MMLV试剂盒反转录 3
1．2．6 cDNA完整性及纯度检测 3
1．2．7 引物设计 4
1．2．8 半定量RTPCR 4
2 结果与分析 4
2．1 葡萄SPL转录因子与miR156家族的序列的BLAST比对分析 4
2．2 RNA提取及分析 5
2．2．1 RNA质量检测与完整性鉴定 5
2．2．2 RNA的OD值分析 5
2.3 cDNA浓度标定与稀释倍数确定 5
2．4 miR156及其靶基因SPL的半定量RTPCR表达分析 6
2.4.1 miR1
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
56在葡萄果实发育成熟过程中的表达分析 6
2.4.2具有miR156靶点的SPL家族成员在葡萄果实发育成熟过程中的表达分析 6
3 讨论 7
致谢 8
参考文献 8
miR156介导SPL调控葡萄果实发育成熟的分子机制
引言
在葡萄中，19条葡萄SPL成员中有12条SPL转录因子具有miR156的靶位点，表明miR156可能调控这12条SPL基因的表达。侯鸿敏尽管在野生葡萄方面曾做过SPB家族的时空表达分析[]，但鲜食葡萄方面尚无系统研究，本实验室前期曾克隆了葡萄SPL（VvSPL9和VvSPL10）转录因子，并发现它们在葡萄不同组织的表达具有显著的时空特异性，它们在葡萄幼果中均有较高水平的表达，随着果实的发育成熟其表达水平逐渐下降甚至消失，表明这些转录因子可能参与葡萄果实发育成熟的调控[,]。为此，本文分析了miR156家族及其靶基因SPL家族的不同成员在葡萄果实成熟过程的时空表达图谱，并利用ABA、NAA处理验证miR156与SPL家族成员在葡萄果实成熟过程的作用，初步鉴定了SPL家族中参与果实成熟过程中的重要成员。本实验的完成有助于从分子水平认识葡萄果实发育成熟的调控机理，为有效利用基因调控葡萄果实发育成熟过程提供理论依据，同时也为其它果树果实成熟的分子调控机制的研究提供重要参考。
1 材料与方法
材料
1．1．1 葡萄材料
基于前期研究基础及开展相关研究工作的需要，本研究拟以江苏省农科院葡萄实验基地的‘巨玫瑰’葡萄为研究试材。依据生产经验结合品种特性，选择葡萄果实发育的七个典型时期（幼果期、幼果膨大期、硬核期、第二次膨大期、转色期、转色中期、成熟期），随机从9株葡萄27个果穗上采集果实样品用于构建转录组文库。
试验材料作如下处理：ABA处理：在转色前1周，选择6穗长势相对一致的果穗，其中3穗用50mg/kg ABA涂抹，另3穗以清水处理作为对照；NAA处理：在转色前1周，与ABA处理相似，也选择6穗果实，其中3穗用200mg/kg NAA涂抹处理，另3穗用清水处理作为对照；对上述两种处理及相应的对照分别在转色期、转色后15天、成熟期动态采集果实样品。
样品采集保证每次从不同果穗的多个不同部位采取，以保证样品的代表性，采集后样品放入液氮速冻，带回实验室70℃保存备用。
1．1．2 主要仪器设备
冷冻离心机；超净工作台；PCR 仪；紫外凝胶成像系统；常温离心机。
1．2 方法
1．2．1 总RNA的提取
葡萄果实总RNA的提取参照张彦苹的SDS方法进行[]，具体步骤如下：
（1）在2ml离心管中样品研磨后加入65℃预热的800μl山梨醇中和50μl β巯基乙醇，混匀，静置5min，8000r/min，5min后取沉淀加入SDS 1100μl，β巯基乙醇55μl。
（2）在65℃水浴锅中放置30min（每隔10min，上下颠倒混匀），在冰盒中冷却，加入氯仿850μl，涡旋混匀后静置5min，离心机12000r/min离心20min；
（3）取1000μl上清液至2ml离心管中，加入1/2体积酚酸，涡旋，冰盒内静置5min，加入1/2体积氯仿（上清：酚酸：氯仿=2:1:1），涡旋混匀后静置2min，离心机12500r/min离心18min；
（4）将离心后的上清液转移到新的1.5ml的离心管中，加入和1/20体积的醋酸钠与1/10体积的无水乙醇，20℃冰箱静置40min；
（5）离心机预冷至4℃， 12500r/min离心18min，转移上清液到新的1.5ml的离心管中（约600μl），加入等体积异丙醇（约600μl），颠倒混匀后放置20℃冰箱中静置56h；
（7）离心机预冷至4℃，样品置入离心机12500r/min离心20min。弃上清，用75%的乙醇（750μl无水乙醇+250μl DEPC水）溶解沉淀，置于4℃，12500r/min离心6min，弃上清，加入750μl无水乙醇，再次4℃，12500r/min离心6min，弃上清，超净工作台上干燥10min，加入35μl经DEPC处理的ddH2O溶解沉淀，40℃保存备用。
1．2．2 总RNA中DNA的消化
为了消除RNA中的DNA，对样品的总RNA进行了 DNA消化。具体消化程序如下:
取大约取40μg总RNA，建立如下DNA消化体系：
表1 DNA消化体系
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