agpp22基因在芹菜栽培品种中的分离与表达分析
植物韧皮部蛋白AgPP2-2在物质运输、维持植物形态、抵御外界伤害等方面起着重要作用。本实验以3个芹菜栽培品种‘六合黄心芹’、‘津南实芹’和美国‘文图拉’为试验材料，分别分离出其韧皮部蛋白AgPP2-2的基因，并进行相关研究。序列分析结果表明，3个芹菜品种的韧皮部蛋白AgPP2-2基因全长906bp，有1个540 bp的开放阅读框及196 bp和167 bp的2个内含子，cDNA长540bp。3种芹菜韧皮部蛋白基因AgPP2-2均编码179个氨基酸，在核苷酸水平上有4个碱基的不同，导致其编码的氨基酸的3个位点的差异。3个芹菜品种的韧皮部蛋白AgPP2-2与忽地笑等植物的韧皮部蛋白均具有PP2超家族的保守结构域。氨基酸组成与理化性质差异较小，预测都属于疏水性蛋白。二级结构也非常相似，主要的组成部分都是卷曲和折叠结构。不同芹菜的不同组织表达分析显示，3种芹菜中，AgPP2-2基因在茎中的表达量最高，根和叶其次，花中表达最低，具有明显的组织特异性。不同逆境处理表达分析初步显示，干旱、盐碱、低温、高温胁迫导致芹菜中AgPP2-2基因表达量均有不同程度的下降，其中,高温变化大于低温变化，干旱变化大于盐碱变化。这为阐明AgPP2-2基因基因在芹菜逆境调控中的作用提供了依据。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）2
1 材料与方法2
1.1 菌种、质粒与试验材料2
1.2 基因组DNA和总RNA的提取及cDNA的合成2
1.3芹菜韧皮部蛋白AgPP22基因的克隆3
1.4 序列分析3
1.5 实时定量PCR反应3
2 结果与分析3
2.1 芹菜韧皮部蛋白AgPP22基因的克隆3
2.2芹菜韧皮部蛋白AgPP22的氨基酸序列分析4
2.3芹菜韧皮部蛋白AgPP22的进化分析 4
2.4芹菜韧皮部蛋白AgPP22的理化性质分析4
2.5芹菜韧皮部蛋白AgPP22基因不同组织和不同逆境处理的表达分析5
3 讨论5
致谢10
参考文献10 一种芹菜韧皮部蛋白基 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
因在不同芹菜栽培品种中的分离与相关研究
引言
芹菜（Apium graveolens L.）属伞形科（Umbelliferae）草本植物，原产于地中海沿岸地区，汉代传入我国，距今已有2000多年的栽培历史，是我国重要的蔬菜作物之一[1]。芹菜富含蛋白质、矿物质、维生素等多种营养成分，茎叶等营养组织中还含有挥发油、芹菜甙、佛手甙内酯等药用成分，具有降血压、调血脂、抗氧化、抗肿瘤、抗菌等药理功效，越来越受人们的亲睐[2,3]。‘六合黄心芹’是南京市六合区的地方优良品种，具有株高较矮，株型半直立，产量高，品质佳，抗逆性强，适应性广，可四季栽培等特点[4]。‘津南实芹’是天津市津南区选育的优良地方品种，具有植株高大，株型紧凑直立，分枝极少，抗性强，适应性广等特点，我国南北四季均可栽培。美国‘文图拉’从美国引进，经多代提纯选育而成，株高高大，株型紧凑，抗病性好，产量高，适合保护地及春秋露地栽培等特点。
植物生长和发育过程中，韧皮部主要负责植物体内水分、无机盐和糖等物质等的运输，并兼有维持植物形态、抵御外界物理伤害的作用[57]。韧皮部蛋白PP2是植物韧皮部汁液中富含的一种蛋白质，是一种特殊的结合几丁质的凝集素，具有韧皮部组织特异性[8]，同时，韧皮部蛋白在植物大分子运输系统中起很重要的标记作用[9]。国外学者对韧皮部蛋白的研究开展比较早。1995年，Toyama从甜瓜、黄瓜等幼苗中克隆出编码PP2亚基的cDNA[10]。1992年，Bostwick对笋瓜PP2分别进行原位杂交与免疫细胞化学反应定位，结果发现PP2的mRNA特异性地定位于韧皮部伴胞中，PP2蛋白分布于伴胞和筛管分子中[11]。分析南瓜属的几个不同品种，发现PP2由一个小的基因家族构成，高度保守[12]。利用韧皮部特异表达启动子，来调节目的基因在韧皮部高效的表达，更经济、有效的发挥某些目的基因的作用[1315]。芹菜中的AgPP22基因主要编码芹菜中的韧皮部蛋白，该蛋白对维持芹菜的形态特征、物质转运等方面有重要作用，目前相对于其它模式植物和大宗蔬菜，伞形科的芹菜AgPP22基因的研究很少。
本实验分别从‘六合黄心芹’、‘津南实芹’和美国‘文图拉’中克隆获得韧皮部蛋白AgPP22基因，对其进行较为详细的序列分析，利用实时定量PCR进行不同组织及不同逆境处理下的表达研究，为进一步深入研究芹菜中韧皮部蛋白的功能和机制奠定基础。
1 材料与方法
1.1菌种、质粒与试验材料
大肠杆菌菌种DH5α由本实验室保存；质粒载体pMD18T vector、DNA分子量标准品、Ex Taq PCR聚合酶和各类限制性内切酶等均为大连TaKaRa公司产品。
试验材料‘六合黄心芹’、‘津南实芹’和美国‘文图拉’均由本实验室保存。2012年秋季将3种芹菜分别种植于大学园艺学院江浦实验园艺场，冬季将其移至大学园艺学院实验大棚，使其安全过冬春化，并生长发育为具有根、茎、叶、花的完整植株。2013年3月，在大学作物遗传与种质创新国家重点实验室人工气候室分别播种3种芹菜，待植株长成2月龄大小时，分别对其进行20 % PEG处理、0.2 molL1 NaCl处理、4 ℃低温处理、38 ℃高温处理，处理时间均为2 h。
1.2 基因组DNA和总RNA的提取及cDNA的合成
采集成熟芹菜植株的根、茎、叶、花以及不同处理的2月龄芹菜植株幼嫩的叶片为试验材料，用于基因组DNA和总RNA的提取及cDNA的合成。
基因组DNA的提取按照DNA试剂盒（DNA simple Total DNA Kit，北京Tiangen公司）说明书进行。
采用 RNA simple Total RNA Kit（Tiangen 公司）试剂盒提取实验材料的总 RNA，再用 1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测总 RNA 的完整性。利用 Prime Script RT reagent Kit（TaKaRa 公司）将提取的总 RNA 反转录成 cDNA。cDNA 合成体系的总体积为 20 μL，反应条件及过程为：总RNA 和50 μmolL1 Oligo（dT）18混液于70 ℃水浴10 min；然后加入MMLV反转录酶（200 U）、dNTP（10 mmolL1）、RNase抑制剂（40 U）（TaKaRa公司）及灭菌的双蒸水，置于42 ℃水浴60 min，最后于70 ℃水浴变性15 min。
1.3 芹菜韧皮部蛋白AgPP22基因的克隆
以GenBank中来源于旱芹（A. graveolens var. dulce）的phloem protein ( AY114140) cDNA序列作为芹菜韧皮部蛋白AgPP22基因克隆引物的参考序列，设计一对引物：上游引物NRX19: 5ATGGCTCAAGTGCAGCGAGATG3和下游引物NRX20: 5TTAGCAGATAACTGGCACAATG3。分别以‘六合黄心芹’、‘津南实芹’和美国‘文图拉’的 DNA和cDNA为模板进行扩增。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）2
1 材料与方法2
1.1 菌种、质粒与试验材料2
1.2 基因组DNA和总RNA的提取及cDNA的合成2
1.3芹菜韧皮部蛋白AgPP22基因的克隆3
1.4 序列分析3
1.5 实时定量PCR反应3
2 结果与分析3
2.1 芹菜韧皮部蛋白AgPP22基因的克隆3
2.2芹菜韧皮部蛋白AgPP22的氨基酸序列分析4
2.3芹菜韧皮部蛋白AgPP22的进化分析 4
2.4芹菜韧皮部蛋白AgPP22的理化性质分析4
2.5芹菜韧皮部蛋白AgPP22基因不同组织和不同逆境处理的表达分析5
3 讨论5
致谢10
参考文献10 一种芹菜韧皮部蛋白基 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
因在不同芹菜栽培品种中的分离与相关研究
引言
芹菜（Apium graveolens L.）属伞形科（Umbelliferae）草本植物，原产于地中海沿岸地区，汉代传入我国，距今已有2000多年的栽培历史，是我国重要的蔬菜作物之一[1]。芹菜富含蛋白质、矿物质、维生素等多种营养成分，茎叶等营养组织中还含有挥发油、芹菜甙、佛手甙内酯等药用成分，具有降血压、调血脂、抗氧化、抗肿瘤、抗菌等药理功效，越来越受人们的亲睐[2,3]。‘六合黄心芹’是南京市六合区的地方优良品种，具有株高较矮，株型半直立，产量高，品质佳，抗逆性强，适应性广，可四季栽培等特点[4]。‘津南实芹’是天津市津南区选育的优良地方品种，具有植株高大，株型紧凑直立，分枝极少，抗性强，适应性广等特点，我国南北四季均可栽培。美国‘文图拉’从美国引进，经多代提纯选育而成，株高高大，株型紧凑，抗病性好，产量高，适合保护地及春秋露地栽培等特点。
植物生长和发育过程中，韧皮部主要负责植物体内水分、无机盐和糖等物质等的运输，并兼有维持植物形态、抵御外界物理伤害的作用[57]。韧皮部蛋白PP2是植物韧皮部汁液中富含的一种蛋白质，是一种特殊的结合几丁质的凝集素，具有韧皮部组织特异性[8]，同时，韧皮部蛋白在植物大分子运输系统中起很重要的标记作用[9]。国外学者对韧皮部蛋白的研究开展比较早。1995年，Toyama从甜瓜、黄瓜等幼苗中克隆出编码PP2亚基的cDNA[10]。1992年，Bostwick对笋瓜PP2分别进行原位杂交与免疫细胞化学反应定位，结果发现PP2的mRNA特异性地定位于韧皮部伴胞中，PP2蛋白分布于伴胞和筛管分子中[11]。分析南瓜属的几个不同品种，发现PP2由一个小的基因家族构成，高度保守[12]。利用韧皮部特异表达启动子，来调节目的基因在韧皮部高效的表达，更经济、有效的发挥某些目的基因的作用[1315]。芹菜中的AgPP22基因主要编码芹菜中的韧皮部蛋白，该蛋白对维持芹菜的形态特征、物质转运等方面有重要作用，目前相对于其它模式植物和大宗蔬菜，伞形科的芹菜AgPP22基因的研究很少。
本实验分别从‘六合黄心芹’、‘津南实芹’和美国‘文图拉’中克隆获得韧皮部蛋白AgPP22基因，对其进行较为详细的序列分析，利用实时定量PCR进行不同组织及不同逆境处理下的表达研究，为进一步深入研究芹菜中韧皮部蛋白的功能和机制奠定基础。
1 材料与方法
1.1菌种、质粒与试验材料
大肠杆菌菌种DH5α由本实验室保存；质粒载体pMD18T vector、DNA分子量标准品、Ex Taq PCR聚合酶和各类限制性内切酶等均为大连TaKaRa公司产品。
试验材料‘六合黄心芹’、‘津南实芹’和美国‘文图拉’均由本实验室保存。2012年秋季将3种芹菜分别种植于大学园艺学院江浦实验园艺场，冬季将其移至大学园艺学院实验大棚，使其安全过冬春化，并生长发育为具有根、茎、叶、花的完整植株。2013年3月，在大学作物遗传与种质创新国家重点实验室人工气候室分别播种3种芹菜，待植株长成2月龄大小时，分别对其进行20 % PEG处理、0.2 molL1 NaCl处理、4 ℃低温处理、38 ℃高温处理，处理时间均为2 h。
1.2 基因组DNA和总RNA的提取及cDNA的合成
采集成熟芹菜植株的根、茎、叶、花以及不同处理的2月龄芹菜植株幼嫩的叶片为试验材料，用于基因组DNA和总RNA的提取及cDNA的合成。
基因组DNA的提取按照DNA试剂盒（DNA simple Total DNA Kit，北京Tiangen公司）说明书进行。
采用 RNA simple Total RNA Kit（Tiangen 公司）试剂盒提取实验材料的总 RNA，再用 1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测总 RNA 的完整性。利用 Prime Script RT reagent Kit（TaKaRa 公司）将提取的总 RNA 反转录成 cDNA。cDNA 合成体系的总体积为 20 μL，反应条件及过程为：总RNA 和50 μmolL1 Oligo（dT）18混液于70 ℃水浴10 min；然后加入MMLV反转录酶（200 U）、dNTP（10 mmolL1）、RNase抑制剂（40 U）（TaKaRa公司）及灭菌的双蒸水，置于42 ℃水浴60 min，最后于70 ℃水浴变性15 min。
1.3 芹菜韧皮部蛋白AgPP22基因的克隆
以GenBank中来源于旱芹（A. graveolens var. dulce）的phloem protein ( AY114140) cDNA序列作为芹菜韧皮部蛋白AgPP22基因克隆引物的参考序列，设计一对引物：上游引物NRX19: 5ATGGCTCAAGTGCAGCGAGATG3和下游引物NRX20: 5TTAGCAGATAACTGGCACAATG3。分别以‘六合黄心芹’、‘津南实芹’和美国‘文图拉’的 DNA和cDNA为模板进行扩增。
版权保护: 本文由 hbsrm.com编辑，转载请保留链接: www.hbsrm.com/nongxue/yy/436.html
