绿色草莓×东北草莓种间杂种鉴定及氨磺乐灵诱导染色体加倍
摘 要本实验以绿色草莓和东北草莓种间杂种LsDb-11-01的茎尖为外植体，在离体快繁技术的基础上用氨磺乐灵为诱导剂进行多倍体诱导，研究不同浓度20、40、60、80、100 mg/L氨磺乐灵在不同处理时间（24、36、48 h）条件下用浸泡法对该草莓株系诱导效果的影响，以及种间杂种和其加倍后幼苗的倍性鉴定。 结果表明倍性鉴定结果为四倍体和混倍体分别有1个和48个，四倍体诱导的最佳处理条件为100 mg/L浓度的氨磺乐灵浸泡茎尖24 h，诱导率最高为2.63 %。
目录
摘 要3
关键词3
引 言3
1 材料与方法5
1.1 实验材料 5
1.2 实验试剂 5
1.3 实验仪器与设备5
1.4 实验内容6
1.4.1 种间杂种形态的形态学观察6
1.4.2 最佳增殖培养基的筛选6
1.4.3 离体茎尖加倍处理6
1.4.4 倍性鉴定7
2 结果与分析7
2.1 形态观察7
2.2 增殖培养基的筛选 8
2.3 流式细胞仪检测种间杂种和诱导处理植株 9
2.4 氨磺乐灵诱导产生多倍体的倍性鉴定结果9
3 讨论11
3.1 诱导处理部位的选择 11
3.2 氨磺乐灵溶液的最适处理浓度与时间 11
3.3 诱导率低的原因及改进 11
3.4 流式细胞仪原理11
4 展望11
参考文献13
图片展示15
致 谢17
绿色草莓×东北草莓种间杂种倍性鉴定及氨磺乐灵诱导染色体加倍
引言
引言
草莓是蔷薇科（Rosaceae）草莓属（Fragaria）多年生草本植物，栽培面积最大的是八倍体凤梨草莓（F. annanassa Duch）。凤梨草莓品种被认为遗传背景狭窄导致草莓的抗逆性减弱，新品种的培育受到限制[1]。我国是世界上野生草莓资源最丰富的国家，全世界草莓属约20个种，我国分布有11个种[2,3]。野生草莓具有广泛的适应性和多种优良性状，是改 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
良栽培草莓如提高品种抗病、抗虫和抗环境胁迫的重要种质[4]。低倍性野生草莓种质中蕴藏着丰富的具有独特香气、四季结果、休眠浅、抗逆性及病虫害等优良性状的基因资源[1]，而我国对野生草莓资源的利用创新水平较低，如何利用野生资源培育草莓新品种是我国草莓育种的紧迫性工作。
多倍体育种是草莓育种重要的方法。多倍体植物由于染色体加倍，其外部形态特征和二倍体有明显的差别，主要表现在根、茎、叶的形态和大小上。一般而言，同源多倍体植株高大，生长势强，茎粗、叶厚，叶片长度、宽度增长率大，叶面积增加，生活力增强，分枝数和叶片数减少，生长期延长。如张纪英等对同源四倍体荞麦的外部形态与普通小麦进行了比较，同源四倍体荞麦植株平均增高19 cm，生长势增强，分枝减弱，生长期延长5~7天，茎秆变粗，叶片变厚增大[5]；Scot观察秋水仙碱加倍的同源四倍体森林草莓（Fragaria vesca）的育性比二倍体低得多，与栽培草莓杂交时得到了从完全不育到完全可育的后代[6]。另外，气孔的密度、大小及在胁迫条件下气孔的开闭规律对研究其适应性、抗逆性有密切的关系，多倍体的适应性和抗逆性更强。多倍体叶片气孔表现巨大性已在许多植物多倍体与二倍体的比较中有过研究，结果表明，多倍体叶片气孔增大，气孔密度下降，保卫细胞内叶绿体数目增多[7,8]。
秋水仙素（Colchicines）是最早用于染色体加倍的试剂，也是最常用的。然而它毒性大，与植物微管蛋白的亲和力较低，不易作用于分生组织细胞，在使用、运输上多有限制且价格昂贵。另外，实验时其高处理浓度以及清除困难使得残留的秋水仙素可能导致被加倍的细胞被重复加倍，这将引起含有不同倍数水平的染色体植株出现[9]。氨磺乐灵与植物蛋白亲和力高、动物蛋白亲和力低，从而具有诱导植物多倍体效率高、环境污染小的特点[10]，另外其价格相对较低，毒性也相对较低，使得它在多倍体诱导方面具有一定优势。自1992年利用氨磺乐灵处理百合（lilium）成功获得了四倍体[11]，随后玫瑰、苹果、黄瓜、西瓜等多种作物利用氨磺乐灵诱导加倍并获得成功[1217]。利用氨磺乐灵对作物加倍的研究成为了国内外多倍体育种领域的研究热点。氨磺乐灵被认为是多倍体的新型诱变剂，有望替代秋水仙素[18]。
本实验所采用的材料是野生二倍体绿色草莓（F. viridis）和东北草莓（F. mandschurica）[19]的种间杂种1号株系，其代号为LsDb1101，其具有不可育性。为探索其加倍后能否克服种间杂种的不育性，实验通过氨磺乐灵对其加倍，初步探索了用氨磺乐灵加倍二倍体草莓的同时，成功获得了LsDb1101加倍后的四倍体植株。种间杂种株系LsDb1101加倍获得的四倍体植株为草莓低倍性杂种的提供了技术参考和特意种质资源。
1 材料与方法
1.1 实验材料
实验材料是由野生二倍体草莓绿色草莓（F. viridis）为母本，东北草莓（F. mandschurica）为父本杂交获得的3个种间杂种株系LsDb1101、LsDb1102、LsDb1103，保存于大学牌楼草莓种质基地。
1.2 实验试剂
诱导剂为氨磺乐灵，购自于SigmaAldrich试剂公司。其分子式为C12H18O6N4S，英文用Oryzalin表示，分子量346.4，原药为淡黄色结晶固体粉末，水溶解度（25℃）为2.4 mg/L，遇紫外光易分解，有毒（毒性较秋水仙素小）。在欧美等国家作为一种芽前除草剂使用，是一种新型二硝基苯胺类除草剂，由美国Dow AgroSciences公司于1973年推出[20]。
其他所用试剂有：6BA、NAA、大量元素母液、微量元素母液、铁盐母液、有机成分母液、蔗糖、琼脂、DMSO（二甲基亚砜）、碘化丙锭染色液（45 mg/L RNase A，10 μg/mL PI）、细胞核提取液（15 mmol/L TrisHCl （pH=7.5），80 mmol/L KCl，20 mmol/L NaCl，20 mmol/L EDTANa2，2.0 % PVP，体积分数0.1 %的TritonX100）、70 %乙醇、0.1 %升汞、蒸馏水、巯基乙醇。
1.3 实验仪器与设备
实验使用的主要仪器设备有：FACScan流式细胞仪、天平（百分之一）、游标卡尺（数显）、pH计、超净工作台、50 mL和250 mL三角瓶、0.22 μm有机系滤头、20 mL和50 mL注射器、枪头、300目尼龙布、培养皿、解剖刀、镊子、乳胶手套、记号笔、PE手套、封口膜、废液瓶、滤纸、报纸、刀片、冰块、泡沫盒、离心管、移液枪。
1.4 实验内容
1.4.1 种间杂种形态的形态学观察
绿色草莓和东北草莓及种间杂种三个株系保存于大学牌楼草莓种质基地。分别对LsDb1101、LsDb1102、LsDb1103杂种以及其父本、母本的形态指标进行测量，测量指标包括植株姿态、植株高度、植株冠径，叶片指标包括叶片的长、宽、颜色、形状、边缘锯齿、质地、正反面绒毛着生状态、叶面状态、小叶数、叶柄长度、叶柄颜色、叶柄绒毛着生状态、托叶颜色、耳叶等。对每个形态指标取3株苗，每株苗测量10次。
目录
摘 要3
关键词3
引 言3
1 材料与方法5
1.1 实验材料 5
1.2 实验试剂 5
1.3 实验仪器与设备5
1.4 实验内容6
1.4.1 种间杂种形态的形态学观察6
1.4.2 最佳增殖培养基的筛选6
1.4.3 离体茎尖加倍处理6
1.4.4 倍性鉴定7
2 结果与分析7
2.1 形态观察7
2.2 增殖培养基的筛选 8
2.3 流式细胞仪检测种间杂种和诱导处理植株 9
2.4 氨磺乐灵诱导产生多倍体的倍性鉴定结果9
3 讨论11
3.1 诱导处理部位的选择 11
3.2 氨磺乐灵溶液的最适处理浓度与时间 11
3.3 诱导率低的原因及改进 11
3.4 流式细胞仪原理11
4 展望11
参考文献13
图片展示15
致 谢17
绿色草莓×东北草莓种间杂种倍性鉴定及氨磺乐灵诱导染色体加倍
引言
引言
草莓是蔷薇科（Rosaceae）草莓属（Fragaria）多年生草本植物，栽培面积最大的是八倍体凤梨草莓（F. annanassa Duch）。凤梨草莓品种被认为遗传背景狭窄导致草莓的抗逆性减弱，新品种的培育受到限制[1]。我国是世界上野生草莓资源最丰富的国家，全世界草莓属约20个种，我国分布有11个种[2,3]。野生草莓具有广泛的适应性和多种优良性状，是改 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
良栽培草莓如提高品种抗病、抗虫和抗环境胁迫的重要种质[4]。低倍性野生草莓种质中蕴藏着丰富的具有独特香气、四季结果、休眠浅、抗逆性及病虫害等优良性状的基因资源[1]，而我国对野生草莓资源的利用创新水平较低，如何利用野生资源培育草莓新品种是我国草莓育种的紧迫性工作。
多倍体育种是草莓育种重要的方法。多倍体植物由于染色体加倍，其外部形态特征和二倍体有明显的差别，主要表现在根、茎、叶的形态和大小上。一般而言，同源多倍体植株高大，生长势强，茎粗、叶厚，叶片长度、宽度增长率大，叶面积增加，生活力增强，分枝数和叶片数减少，生长期延长。如张纪英等对同源四倍体荞麦的外部形态与普通小麦进行了比较，同源四倍体荞麦植株平均增高19 cm，生长势增强，分枝减弱，生长期延长5~7天，茎秆变粗，叶片变厚增大[5]；Scot观察秋水仙碱加倍的同源四倍体森林草莓（Fragaria vesca）的育性比二倍体低得多，与栽培草莓杂交时得到了从完全不育到完全可育的后代[6]。另外，气孔的密度、大小及在胁迫条件下气孔的开闭规律对研究其适应性、抗逆性有密切的关系，多倍体的适应性和抗逆性更强。多倍体叶片气孔表现巨大性已在许多植物多倍体与二倍体的比较中有过研究，结果表明，多倍体叶片气孔增大，气孔密度下降，保卫细胞内叶绿体数目增多[7,8]。
秋水仙素（Colchicines）是最早用于染色体加倍的试剂，也是最常用的。然而它毒性大，与植物微管蛋白的亲和力较低，不易作用于分生组织细胞，在使用、运输上多有限制且价格昂贵。另外，实验时其高处理浓度以及清除困难使得残留的秋水仙素可能导致被加倍的细胞被重复加倍，这将引起含有不同倍数水平的染色体植株出现[9]。氨磺乐灵与植物蛋白亲和力高、动物蛋白亲和力低，从而具有诱导植物多倍体效率高、环境污染小的特点[10]，另外其价格相对较低，毒性也相对较低，使得它在多倍体诱导方面具有一定优势。自1992年利用氨磺乐灵处理百合（lilium）成功获得了四倍体[11]，随后玫瑰、苹果、黄瓜、西瓜等多种作物利用氨磺乐灵诱导加倍并获得成功[1217]。利用氨磺乐灵对作物加倍的研究成为了国内外多倍体育种领域的研究热点。氨磺乐灵被认为是多倍体的新型诱变剂，有望替代秋水仙素[18]。
本实验所采用的材料是野生二倍体绿色草莓（F. viridis）和东北草莓（F. mandschurica）[19]的种间杂种1号株系，其代号为LsDb1101，其具有不可育性。为探索其加倍后能否克服种间杂种的不育性，实验通过氨磺乐灵对其加倍，初步探索了用氨磺乐灵加倍二倍体草莓的同时，成功获得了LsDb1101加倍后的四倍体植株。种间杂种株系LsDb1101加倍获得的四倍体植株为草莓低倍性杂种的提供了技术参考和特意种质资源。
1 材料与方法
1.1 实验材料
实验材料是由野生二倍体草莓绿色草莓（F. viridis）为母本，东北草莓（F. mandschurica）为父本杂交获得的3个种间杂种株系LsDb1101、LsDb1102、LsDb1103，保存于大学牌楼草莓种质基地。
1.2 实验试剂
诱导剂为氨磺乐灵，购自于SigmaAldrich试剂公司。其分子式为C12H18O6N4S，英文用Oryzalin表示，分子量346.4，原药为淡黄色结晶固体粉末，水溶解度（25℃）为2.4 mg/L，遇紫外光易分解，有毒（毒性较秋水仙素小）。在欧美等国家作为一种芽前除草剂使用，是一种新型二硝基苯胺类除草剂，由美国Dow AgroSciences公司于1973年推出[20]。
其他所用试剂有：6BA、NAA、大量元素母液、微量元素母液、铁盐母液、有机成分母液、蔗糖、琼脂、DMSO（二甲基亚砜）、碘化丙锭染色液（45 mg/L RNase A，10 μg/mL PI）、细胞核提取液（15 mmol/L TrisHCl （pH=7.5），80 mmol/L KCl，20 mmol/L NaCl，20 mmol/L EDTANa2，2.0 % PVP，体积分数0.1 %的TritonX100）、70 %乙醇、0.1 %升汞、蒸馏水、巯基乙醇。
1.3 实验仪器与设备
实验使用的主要仪器设备有：FACScan流式细胞仪、天平（百分之一）、游标卡尺（数显）、pH计、超净工作台、50 mL和250 mL三角瓶、0.22 μm有机系滤头、20 mL和50 mL注射器、枪头、300目尼龙布、培养皿、解剖刀、镊子、乳胶手套、记号笔、PE手套、封口膜、废液瓶、滤纸、报纸、刀片、冰块、泡沫盒、离心管、移液枪。
1.4 实验内容
1.4.1 种间杂种形态的形态学观察
绿色草莓和东北草莓及种间杂种三个株系保存于大学牌楼草莓种质基地。分别对LsDb1101、LsDb1102、LsDb1103杂种以及其父本、母本的形态指标进行测量，测量指标包括植株姿态、植株高度、植株冠径，叶片指标包括叶片的长、宽、颜色、形状、边缘锯齿、质地、正反面绒毛着生状态、叶面状态、小叶数、叶柄长度、叶柄颜色、叶柄绒毛着生状态、托叶颜色、耳叶等。对每个形态指标取3株苗，每株苗测量10次。
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