用秋水仙素处理洋葱花原基诱导四倍体
摘要：2关键词2Abstract2Key words2引言21.材料与方法31.1 材料 31.1.1供试材料31.1.2处理试剂31.1.3处理工具31.2 实验方法 31.2.1处理方法31.2.2处理方法31.2.3二倍体花粉鉴定31.2.4多倍体植株的获得与鉴定32.结果与分析42.1秋水仙素处理对诱导洋葱二倍体花粉的影响52.2四倍体植株的获得与鉴定 53讨论 5致谢6参考文献6用秋水仙素处理洋葱花原基诱导四倍体摘要：本研究以洋葱（Allium cepa L.）品种‘W462’抽薹期花苞为处理材料，研究采用不同浓度秋水仙碱进行处理及不同处理次数对洋葱四倍体诱导的影响，以期建立一种田间处理条件下诱导洋葱四倍体的方法体系。当洋葱于4月中旬进入抽薹期，采用浓度为0.05 g/L，0.1 g/L，0.15 g/L，0.2 g/L的秋水仙素溶液处理洋葱花苞腔内原基生长点，分别采用注射法及涂抹法进行处理。初期鉴定是否诱导出洋葱二倍体花粉，并进行后续实验鉴定是否获得四倍体洋葱植株。初期实验结果表明通过诱导得到了洋葱二倍体花粉，而后续实验中并未获得洋葱四倍体植株，本文将对实验结果进行深入讨论，提出优化解决方案。
目录
引言
洋葱(Allium cepa L.)，百合科葱属中以肉质鳞片和鳞芽构成产品器官的二年生草本植物，洋葱富含的多种硫化物和糖类是其独特风味的主要成分,具有降低和预防血栓形成、降血脂、降血压、抗动脉硬化、预防心肌梗塞的作用,可广泛应用于食品、医药和保健领域,洋葱已成为越来越重要的植物资源[1]。洋葱是异花授粉作物，传统育种手法存在如育种效率低、育种周期长等难题。我国的洋葱育种起步较晚,因洋葱的自然生育周期较长,长期以来,育种家们主要进行常规育种和品种引进[2]。本文主要综述了洋葱的种质资源和遗传育种研究进展,并对洋葱育种工作的进一步开展提出建议,以期为我国的洋葱育种发展提供参考。
多倍体植物由于染色体的加倍,产品的营养器官具有巨大性,营养成份含量高及抗逆性强等优异特性,多倍体育种可以大大增强作物的营养价值和商品价值。组织培养结合秋水仙素诱导植物多倍体的技术手段得以应用,并伴随组织培养技术的发展而曰趋成熟。洋葱以营养器官肉质鳞茎为产品,其多倍体育种在洋葱育种上具有重要意义,另外可以提供更多的种质资源[3]。<
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
br /> 在实体人工加倍处理法中,普遍采用注射法、涂抹法、浸种法及包埋法,常用方法通过处理植物的茎尖或用秋水仙素溶液浸泡种子等达到目的。其中运用秋水仙素水溶液直接浸泡种子的方法成功地在君子兰[4]、菊花脑[5]、油菜[6]等植物上诱导出了多倍体。用注射器将秋水仙素注入生长点的方法在成龄桑上成功的诱导四倍体[7],但针头易刺伤生长点,而造成生长点霉烂死亡,诱导效率低。陈绍潘等用涂抹生长点方法处理甜菊实生苗时,用8次点滴处理,诱变率可达31.25%[8]。人们在研究中发现,在实体人工诱导加倍中,秋水仙素作用的主要对象是生长点,只有生长点的细胞全部加倍,才能获得加倍成功的植株,但这种几率很小,由此获得加倍材料多为嵌合体,往往不能稳定遗传,而且受环境干扰大,并且可能产生回复突变[9]。
秋水仙素(colchicine)可通过抑制或破坏有丝分裂阶段纺锤体的形成，使染色体停滞在分裂中期。这种由秋水仙素引起的不正常分裂，染色体虽然纵裂，但细胞不分离，不能形成两个子细胞，因而使染色体加倍，是目前较为理想的多倍体诱变剂[10]。秋水仙素通常采用浸种、滴涂和注射生长点等方法诱导植物无性阶段产生多倍体[11][12]。
本实验以抽薹期洋葱花序花原基为实验材料，分别采用秋水仙素注射法和涂抹法处理花序花原基生长点，研究秋水仙素对洋葱二倍体种子形成的诱导影响，并将所得四倍体洋葱种子播种到地里，然后待其长成幼苗后再做倍性鉴定，以期获得四倍体洋葱植株，为洋葱多倍体诱导育种和新种质的创新提供新的途径。
1 材料与方法
1．1 实验材料
1．1．1 供试材料
大学园艺站所提供的洋葱‘W462’品种。
1．1．2 处理试剂
秋水仙素、琼脂、蒸馏水
1．1．3 处理工具
棉签、1 ml注射器、授粉袋、大头针、50 ml三角瓶、50 ml棕色广口瓶。
1．2 实验方法
1．2．1 处理浓度 采用秋水仙素处理浓度为0.05 g/L，0.1 g/L，0.15 g/L，0.2 g/L，以点滴蒸馏水（0%）为对照。
1．2．2 处理方法 注射法：用注射器对花苞腔注射秋水仙素处理花苞腔内原基生长点：共处理100株花苞，均分为注射1次、注射2次两批，10次重复，第二天对注射2次批次进行再次注射，于每天下午15:00进行注射诱导，注射完后套袋挂牌。
涂抹法：将洋葱花葶苞片剥开，用秋水仙素混合琼脂涂抹花苞腔内原基生长点：共处理100株花苞，均分为涂抹1次、涂抹2次两批，，10次重复，第二天对涂抹2次批次进行再次涂抹，于每天下午15:00进行涂抹诱导，涂抹完后套袋挂牌。
图1 注射秋水仙素处理洋葱花苞
Fig.1 Inject Allium cepa L’s bud by colchicine
1．2．3 二倍体花粉粒鉴定 秋水仙素处理15天后，洋葱进入盛花期，分组采集洋葱花粉粒。先于农场对每一组花粉进行初步显微镜观察，通过鉴别花粉形态特征而判别是否获得二倍体花粉，与二倍体相比，多倍体的花粉粒较大、萌发孔数目多、花粉粒形状变化明显，这些特征可作为多倍体鉴定的依据之一[13]。后带回实验室用醋酸洋红染色,光镜下观测染色花粉粒的形状和大小。花粉粒形状的比较: 观察视野中不同形状花粉粒的数目,记录二倍体花粉编号。
1．2．4 四倍体植株的获得和鉴定 收集经倍性鉴定证明为四倍体的洋葱花序种子播种于实验地中，采用常规田间水肥管理，待其长出约3cm的根后，对植株进行形态鉴定，多倍体植株在形态上通常表现出生长健旺、茎粗、叶片厚等巨大性特点，而且多倍体植株的叶色变深，叶面皱缩粗糙。以‘W462’品种洋葱正常的二倍体植株为对照，比较多倍体与正常二倍体植株的生长势、叶色、叶厚、植株形状等相关指标鉴定，用于初步判定倍性。然后采用根尖染色体观察的方法确定多倍体的倍性情况。
根尖染色体鉴定:
(1)取材:待根长到约3cm时，取1.5 cm左右根尖；
(2)预处理:将取的根尖置于八羟基奎宁溶液室温处理3h；
(3)固定:将预处理的根尖用蒸馏水清洗35次，用卡诺固定液中固定24h。卡诺固定液:酒精:冰醋酸(V/V) =3:1。无水乙醇作用是杀死细胞，乙酸的作用是支撑细胞，使细胞保持形态(渗透压高)。现配现用，保存于4℃冰箱。
(4)解离:材料用蒸馏水清洗35次，放入1molL盐酸中水浴恒温60 ℃解离58 min，以使果胶类物质解离，使细胞易于分散，便于压片；材料经解离后，用蒸馏水清洗35次，并保存在蒸馏水中。
(5)染色:处理过的材料置于载破片上，卡宝染色5 min。
(6)制片:盖上盖玻片，手指轻压，然后烤片；用带橡皮头的铅笔轻敲用力均勾使细胞散 。
(7)镜检拍照:将制好的染色体临时装片置于显微镜下观察，选出好的制片在Olypus BX41显微镜下观察并用PM10全自动照相系统拍照。
2 结果与分析
2．1 秋水仙素注射法对诱导洋葱二倍体花粉的影响
如表1中所示，随着秋水仙素处理浓度的增大，洋葱二倍体花粉的诱导率增高，在0.05g/L~0.10g/L处理浓度间诱导率达到最高，之后处理浓度再增大都导致二倍体洋葱花粉的诱导率为0。故得出结论0.05%~0.10%的秋水仙素对二倍体洋葱花粉的诱导均有效，而在其他浓度下的诱导成功率都为0，相同浓度下处理次数越多诱导率越高。
目录
引言
洋葱(Allium cepa L.)，百合科葱属中以肉质鳞片和鳞芽构成产品器官的二年生草本植物，洋葱富含的多种硫化物和糖类是其独特风味的主要成分,具有降低和预防血栓形成、降血脂、降血压、抗动脉硬化、预防心肌梗塞的作用,可广泛应用于食品、医药和保健领域,洋葱已成为越来越重要的植物资源[1]。洋葱是异花授粉作物，传统育种手法存在如育种效率低、育种周期长等难题。我国的洋葱育种起步较晚,因洋葱的自然生育周期较长,长期以来,育种家们主要进行常规育种和品种引进[2]。本文主要综述了洋葱的种质资源和遗传育种研究进展,并对洋葱育种工作的进一步开展提出建议,以期为我国的洋葱育种发展提供参考。
多倍体植物由于染色体的加倍,产品的营养器官具有巨大性,营养成份含量高及抗逆性强等优异特性,多倍体育种可以大大增强作物的营养价值和商品价值。组织培养结合秋水仙素诱导植物多倍体的技术手段得以应用,并伴随组织培养技术的发展而曰趋成熟。洋葱以营养器官肉质鳞茎为产品,其多倍体育种在洋葱育种上具有重要意义,另外可以提供更多的种质资源[3]。<
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br /> 在实体人工加倍处理法中,普遍采用注射法、涂抹法、浸种法及包埋法,常用方法通过处理植物的茎尖或用秋水仙素溶液浸泡种子等达到目的。其中运用秋水仙素水溶液直接浸泡种子的方法成功地在君子兰[4]、菊花脑[5]、油菜[6]等植物上诱导出了多倍体。用注射器将秋水仙素注入生长点的方法在成龄桑上成功的诱导四倍体[7],但针头易刺伤生长点,而造成生长点霉烂死亡,诱导效率低。陈绍潘等用涂抹生长点方法处理甜菊实生苗时,用8次点滴处理,诱变率可达31.25%[8]。人们在研究中发现,在实体人工诱导加倍中,秋水仙素作用的主要对象是生长点,只有生长点的细胞全部加倍,才能获得加倍成功的植株,但这种几率很小,由此获得加倍材料多为嵌合体,往往不能稳定遗传,而且受环境干扰大,并且可能产生回复突变[9]。
秋水仙素(colchicine)可通过抑制或破坏有丝分裂阶段纺锤体的形成，使染色体停滞在分裂中期。这种由秋水仙素引起的不正常分裂，染色体虽然纵裂，但细胞不分离，不能形成两个子细胞，因而使染色体加倍，是目前较为理想的多倍体诱变剂[10]。秋水仙素通常采用浸种、滴涂和注射生长点等方法诱导植物无性阶段产生多倍体[11][12]。
本实验以抽薹期洋葱花序花原基为实验材料，分别采用秋水仙素注射法和涂抹法处理花序花原基生长点，研究秋水仙素对洋葱二倍体种子形成的诱导影响，并将所得四倍体洋葱种子播种到地里，然后待其长成幼苗后再做倍性鉴定，以期获得四倍体洋葱植株，为洋葱多倍体诱导育种和新种质的创新提供新的途径。
1 材料与方法
1．1 实验材料
1．1．1 供试材料
大学园艺站所提供的洋葱‘W462’品种。
1．1．2 处理试剂
秋水仙素、琼脂、蒸馏水
1．1．3 处理工具
棉签、1 ml注射器、授粉袋、大头针、50 ml三角瓶、50 ml棕色广口瓶。
1．2 实验方法
1．2．1 处理浓度 采用秋水仙素处理浓度为0.05 g/L，0.1 g/L，0.15 g/L，0.2 g/L，以点滴蒸馏水（0%）为对照。
1．2．2 处理方法 注射法：用注射器对花苞腔注射秋水仙素处理花苞腔内原基生长点：共处理100株花苞，均分为注射1次、注射2次两批，10次重复，第二天对注射2次批次进行再次注射，于每天下午15:00进行注射诱导，注射完后套袋挂牌。
涂抹法：将洋葱花葶苞片剥开，用秋水仙素混合琼脂涂抹花苞腔内原基生长点：共处理100株花苞，均分为涂抹1次、涂抹2次两批，，10次重复，第二天对涂抹2次批次进行再次涂抹，于每天下午15:00进行涂抹诱导，涂抹完后套袋挂牌。
图1 注射秋水仙素处理洋葱花苞
Fig.1 Inject Allium cepa L’s bud by colchicine
1．2．3 二倍体花粉粒鉴定 秋水仙素处理15天后，洋葱进入盛花期，分组采集洋葱花粉粒。先于农场对每一组花粉进行初步显微镜观察，通过鉴别花粉形态特征而判别是否获得二倍体花粉，与二倍体相比，多倍体的花粉粒较大、萌发孔数目多、花粉粒形状变化明显，这些特征可作为多倍体鉴定的依据之一[13]。后带回实验室用醋酸洋红染色,光镜下观测染色花粉粒的形状和大小。花粉粒形状的比较: 观察视野中不同形状花粉粒的数目,记录二倍体花粉编号。
1．2．4 四倍体植株的获得和鉴定 收集经倍性鉴定证明为四倍体的洋葱花序种子播种于实验地中，采用常规田间水肥管理，待其长出约3cm的根后，对植株进行形态鉴定，多倍体植株在形态上通常表现出生长健旺、茎粗、叶片厚等巨大性特点，而且多倍体植株的叶色变深，叶面皱缩粗糙。以‘W462’品种洋葱正常的二倍体植株为对照，比较多倍体与正常二倍体植株的生长势、叶色、叶厚、植株形状等相关指标鉴定，用于初步判定倍性。然后采用根尖染色体观察的方法确定多倍体的倍性情况。
根尖染色体鉴定:
(1)取材:待根长到约3cm时，取1.5 cm左右根尖；
(2)预处理:将取的根尖置于八羟基奎宁溶液室温处理3h；
(3)固定:将预处理的根尖用蒸馏水清洗35次，用卡诺固定液中固定24h。卡诺固定液:酒精:冰醋酸(V/V) =3:1。无水乙醇作用是杀死细胞，乙酸的作用是支撑细胞，使细胞保持形态(渗透压高)。现配现用，保存于4℃冰箱。
(4)解离:材料用蒸馏水清洗35次，放入1molL盐酸中水浴恒温60 ℃解离58 min，以使果胶类物质解离，使细胞易于分散，便于压片；材料经解离后，用蒸馏水清洗35次，并保存在蒸馏水中。
(5)染色:处理过的材料置于载破片上，卡宝染色5 min。
(6)制片:盖上盖玻片，手指轻压，然后烤片；用带橡皮头的铅笔轻敲用力均勾使细胞散 。
(7)镜检拍照:将制好的染色体临时装片置于显微镜下观察，选出好的制片在Olypus BX41显微镜下观察并用PM10全自动照相系统拍照。
2 结果与分析
2．1 秋水仙素注射法对诱导洋葱二倍体花粉的影响
如表1中所示，随着秋水仙素处理浓度的增大，洋葱二倍体花粉的诱导率增高，在0.05g/L~0.10g/L处理浓度间诱导率达到最高，之后处理浓度再增大都导致二倍体洋葱花粉的诱导率为0。故得出结论0.05%~0.10%的秋水仙素对二倍体洋葱花粉的诱导均有效，而在其他浓度下的诱导成功率都为0，相同浓度下处理次数越多诱导率越高。
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