酵母双杂交验证四种水稻蛋白与rbsdv p52蛋白互作(附件)
水稻黑条矮缩病（RBSDV）属于呼肠孤病毒科斐济病毒属。该病毒引发水稻黑条矮缩病，寄主受RBSDV侵染后，会显示出植株变矮、叶片深绿的症状，其最大特征是叶脉上产生了长度不同的蜡白色短条状突起。RBSDV的病原特征、传播途径等生物学特性和基因结构以及功能解析已有所研究，但其分子变异、进化机制和致病机理还不十分清楚。酵母双杂交技术是一种研究蛋白质之间相互作用的有效手段。目前，关于RBSDV与寄主水稻间的互作研究较少，本研究初步验证RBSDV P5-2蛋白与四个水稻蛋白互作，对进一步研究病毒蛋白功能、致病机制、病害防治有着重要意义。关键词 P5-2蛋白，RBSDV，酵母双杂交，蛋白互作
目 录
1 引言 1
1.1 RBSDV的发生和病原特征 1
1.2 RBSDV基因组结构 1
1.3 酵母双杂交基本原理 2
1.4 本课题的目的和意义 2
2 材料与方法 2
2.1 实验材料 2
2.2 实验方法 3
3 结果与分析 8
3.1 目的基因的PCR扩增及纯化 8
3.2 菌落PCR及大肠杆菌质粒的提取 10
3.3 酵母双杂交的进行及分析 11
结 论 13
致 谢 14
参 考 文 献 15
1 引言
水稻黑条矮缩病毒属于呼肠孤病毒科斐济病毒属 [1]。通过介体灰飞虱以增殖型持久性方式来传播，在取食过程中传到寄主植物中[23]，从而侵染植物[4]。水稻在受到RBSDV侵染后会引发水稻黑条矮缩病，玉米受到侵染后会引发玉米粗缩病[57]。灰飞虱作为主要的获毒介体，其只要一旦感染上病毒就会毕生带毒，但不会经虫卵传播[89]。水稻黑条矮缩病毒能够在褐飞虱体中循环积累，但无明显症状 [10]。寄主一旦感染水稻黑条矮缩病毒后，会显示出植株变矮、叶片深绿的症状 [11]。近年来，由于气候变暖和土地耕作方面等原因，灰飞虱数量急速增加，导致RBSDV传播迅速引起水稻黑条矮缩病的流行性爆发[12]，严重影响了中国的粮食生产[13]。
1.1 RBSDV的发生和病原特征
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1941日本首次报道水稻黑条矮缩病的发生，这是日本首次流行性爆发的病害，引发此病害的病原物就是RBSDV[14]。该病害现已是东亚地区主要病害之一，每次发生都会造成农业上的巨大损失。该病于1963年在浙江余姚县发现并报道。20世纪90年代，华北华东地区的稻田成为水稻黑条矮缩病害的主要流行爆发之地，造成了不可估量的经济损失。完整的病毒粒子呈现出正二十面体的构造，看上去呈一个球形，共有12个顶点。其表现出较强的侵染植物的能力，据研究表明RBSDV进入到寄主植物体内后是位于韧皮部的细胞中的，特别是在肿瘤细胞的细胞质中显得尤为突出，而对于介体昆虫来说，病毒在其体内的分布是不存在组织特异性的。据观察，没有成熟的核心病毒颗粒积聚在毒质内部，而完整的病毒颗粒则分布在毒质的周围，这表明毒质可能是病毒复制和装配的位点。
1.2 RBSDV基因组结构
该病毒基因组由10个线性双链RNA构成，，根据其在PAAG上由快到慢的迁移率依次排为S1S10。水稻黑条矮缩病毒中的S5为双顺反子，其编码2个不同大小和等电点的蛋白质：P51与P52。与已知的病毒粒体基因组相比，推测P52可能与病毒在水稻中增殖有关[15]。免疫印迹试验分析，P52在感染病毒的植物中能检测到，而纯化的病毒颗粒中无法检测到，表明它是一种非结构蛋白。免疫电镜技术分析，P52定位于叶绿体。已有文章表明P52独立于其他的病毒因子定位于叶绿体，而且其N端起着重要的作用[16]。虽然P52靶标叶绿体的结构没有明显的细胞影响，但是它或许与叶绿体的功能受损有关，即P52或许参与了病毒引起植物病状的形成[16]。
1.3 酵母双杂交基本原理
酵母双杂在对于研究两个蛋白是否存在互作关系上已有广泛的应用，并且在对于植物和病毒蛋白间是否存在互作也有了比较大的发展。 酵母双杂交可以准确地分析已知蛋白质之间的相互作用，具有可靠性高、效率高、灵敏度高、通用性强等优点[17]。BD与AD在单独存在的情况下不能激活下游基因上几点，因此将酵母转录因子GAL4分为两部分。酵母表达载体作为一个桥梁，将要探讨的蛋白分别与BD和AD结合。若研究对象蛋白质间相互吸引且连接起来，BD和AD的两个所在领域彼此接近，通过非共价模式组成完整的转录因子，通过结合DNA上游的活化序列，从而对于报告基因的表达可以达到激活的目的。相反，假设测试蛋白质之间没有相互作用，BD和AD不能接近，下游报告基因转录也就不能激活，利用GAL4这一特性，根据下游基因是否表达来判断研究对象的蛋白之间是否存在互作。
1.4 本课题的目的和意义
中国是一个巨大的农业大国，发生在水稻上的病毒病多达10余种，特别是作为一传统的病害水稻黑条矮缩病，严重危害了中国的的水稻生产，对我国的粮食生产带来了巨大的威胁。水稻黑条矮缩病致使水稻生长发育畸形、结实率低,造成严重的经济损失,并影响社会稳定。?目前在生产上缺乏理想的水稻抗性品种和防治药剂。?因此,深入研究该病害,探索该病害的致病机理,为今后开发有效的生物制剂、选育抗性品种、制定合理的防治措施奠定基础,?并对其它水稻病毒病的研究提供一定的借鉴,从而具有重要的经济意义和学术价值。本研究将P52蛋白与初步获得的4个互作蛋白采用酵母双杂交进行互作验证，来解析病毒与水稻互作的分子机制，对于深入的探讨病毒蛋白的功能、治疗疾病的机制及疾病的预防都有着深远的意义。
2 材料与方法
2.1 实验材料
用于PCR产物回收的试剂盒来自华普生物科技有限公司，用于提取质粒DNA的试剂盒来自Axygen公司。大肠杆菌感受态cell trans10来自全式金生物技术有限公司，去基因组反转录试剂盒来自TaKaRa公司，酵母双杂交试剂盒来自Clontech公司。测序由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。
目 录
1 引言 1
1.1 RBSDV的发生和病原特征 1
1.2 RBSDV基因组结构 1
1.3 酵母双杂交基本原理 2
1.4 本课题的目的和意义 2
2 材料与方法 2
2.1 实验材料 2
2.2 实验方法 3
3 结果与分析 8
3.1 目的基因的PCR扩增及纯化 8
3.2 菌落PCR及大肠杆菌质粒的提取 10
3.3 酵母双杂交的进行及分析 11
结 论 13
致 谢 14
参 考 文 献 15
1 引言
水稻黑条矮缩病毒属于呼肠孤病毒科斐济病毒属 [1]。通过介体灰飞虱以增殖型持久性方式来传播，在取食过程中传到寄主植物中[23]，从而侵染植物[4]。水稻在受到RBSDV侵染后会引发水稻黑条矮缩病，玉米受到侵染后会引发玉米粗缩病[57]。灰飞虱作为主要的获毒介体，其只要一旦感染上病毒就会毕生带毒，但不会经虫卵传播[89]。水稻黑条矮缩病毒能够在褐飞虱体中循环积累，但无明显症状 [10]。寄主一旦感染水稻黑条矮缩病毒后，会显示出植株变矮、叶片深绿的症状 [11]。近年来，由于气候变暖和土地耕作方面等原因，灰飞虱数量急速增加，导致RBSDV传播迅速引起水稻黑条矮缩病的流行性爆发[12]，严重影响了中国的粮食生产[13]。
1.1 RBSDV的发生和病原特征
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
1941日本首次报道水稻黑条矮缩病的发生，这是日本首次流行性爆发的病害，引发此病害的病原物就是RBSDV[14]。该病害现已是东亚地区主要病害之一，每次发生都会造成农业上的巨大损失。该病于1963年在浙江余姚县发现并报道。20世纪90年代，华北华东地区的稻田成为水稻黑条矮缩病害的主要流行爆发之地，造成了不可估量的经济损失。完整的病毒粒子呈现出正二十面体的构造，看上去呈一个球形，共有12个顶点。其表现出较强的侵染植物的能力，据研究表明RBSDV进入到寄主植物体内后是位于韧皮部的细胞中的，特别是在肿瘤细胞的细胞质中显得尤为突出，而对于介体昆虫来说，病毒在其体内的分布是不存在组织特异性的。据观察，没有成熟的核心病毒颗粒积聚在毒质内部，而完整的病毒颗粒则分布在毒质的周围，这表明毒质可能是病毒复制和装配的位点。
1.2 RBSDV基因组结构
该病毒基因组由10个线性双链RNA构成，，根据其在PAAG上由快到慢的迁移率依次排为S1S10。水稻黑条矮缩病毒中的S5为双顺反子，其编码2个不同大小和等电点的蛋白质：P51与P52。与已知的病毒粒体基因组相比，推测P52可能与病毒在水稻中增殖有关[15]。免疫印迹试验分析，P52在感染病毒的植物中能检测到，而纯化的病毒颗粒中无法检测到，表明它是一种非结构蛋白。免疫电镜技术分析，P52定位于叶绿体。已有文章表明P52独立于其他的病毒因子定位于叶绿体，而且其N端起着重要的作用[16]。虽然P52靶标叶绿体的结构没有明显的细胞影响，但是它或许与叶绿体的功能受损有关，即P52或许参与了病毒引起植物病状的形成[16]。
1.3 酵母双杂交基本原理
酵母双杂在对于研究两个蛋白是否存在互作关系上已有广泛的应用，并且在对于植物和病毒蛋白间是否存在互作也有了比较大的发展。 酵母双杂交可以准确地分析已知蛋白质之间的相互作用，具有可靠性高、效率高、灵敏度高、通用性强等优点[17]。BD与AD在单独存在的情况下不能激活下游基因上几点，因此将酵母转录因子GAL4分为两部分。酵母表达载体作为一个桥梁，将要探讨的蛋白分别与BD和AD结合。若研究对象蛋白质间相互吸引且连接起来，BD和AD的两个所在领域彼此接近，通过非共价模式组成完整的转录因子，通过结合DNA上游的活化序列，从而对于报告基因的表达可以达到激活的目的。相反，假设测试蛋白质之间没有相互作用，BD和AD不能接近，下游报告基因转录也就不能激活，利用GAL4这一特性，根据下游基因是否表达来判断研究对象的蛋白之间是否存在互作。
1.4 本课题的目的和意义
中国是一个巨大的农业大国，发生在水稻上的病毒病多达10余种，特别是作为一传统的病害水稻黑条矮缩病，严重危害了中国的的水稻生产，对我国的粮食生产带来了巨大的威胁。水稻黑条矮缩病致使水稻生长发育畸形、结实率低,造成严重的经济损失,并影响社会稳定。?目前在生产上缺乏理想的水稻抗性品种和防治药剂。?因此,深入研究该病害,探索该病害的致病机理,为今后开发有效的生物制剂、选育抗性品种、制定合理的防治措施奠定基础,?并对其它水稻病毒病的研究提供一定的借鉴,从而具有重要的经济意义和学术价值。本研究将P52蛋白与初步获得的4个互作蛋白采用酵母双杂交进行互作验证，来解析病毒与水稻互作的分子机制，对于深入的探讨病毒蛋白的功能、治疗疾病的机制及疾病的预防都有着深远的意义。
2 材料与方法
2.1 实验材料
用于PCR产物回收的试剂盒来自华普生物科技有限公司，用于提取质粒DNA的试剂盒来自Axygen公司。大肠杆菌感受态cell trans10来自全式金生物技术有限公司，去基因组反转录试剂盒来自TaKaRa公司，酵母双杂交试剂盒来自Clontech公司。测序由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。
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