农杆菌介导的不结球白菜突变体库
不结球白菜（Brassica campestris ssp.chinensis Makino）俗称青菜、小白菜，原产中国，是十字花科芸薹属芸薹种的以肥厚的叶柄和绿色叶片为主要食用器官的一年生或者两年生草本植物。建立不结球白菜突变体库是功能基因组学研究的有效办法。而通过激活标记的农杆菌介导插入T-DNA突变体[1]是不结球白菜转化的最常用且有效的方法，利用高效的农杆菌转化系统对不结球白菜进行转化并得到转化数据，从而建立不结球白菜的突变体库。本实验通过含有激活标记质粒pSK1015的农杆菌转化不结球白菜‘49菜心’，以抗除草剂Basta为筛选标记，构建了不结球白菜突变体库，其中总共得到约31 个突变株（T1 代），其中8 个突变株有明显的表型变化，约占突变植株总数的25.8 %。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 材料准备 2
1.2 外植体的制备以及农杆菌侵染外植体2
1.2.1 外植体的制备2
1.2.2 农杆菌的制备3
1.2.3 芽、根的诱导和筛选转化3
1.2.4 温室驯化及移栽3
2 结果分析4
2.1 设计得到含有激活标记质粒PSKI015的引物4
2.2 PCR测定与植株统计分析4
3 讨论 5
3.1组培法侵染不结球白菜的优缺点5
3.2农杆菌菌株和载体5
3.3激活标签技术的运用对于本实验的影响 5
3.4 建立不结球白菜突变体库的意义 5
致谢6
参考文献6
图1农杆菌介导的通过组织培养途径的不结球白菜转化3
图2通过以抗除草剂Basta为筛选标记的含有激活标记质粒pSK1015的农杆菌转化4
图3 PCR测定得到的结果4
图4 转化后菜心植株的表型5
表1 实验植株的统计数据5
农杆菌介导法的不结球白菜突变体库的建立
引言
不结球白菜突变体库的建立是一个庞大的 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
工程，不结球白菜突变体库的构建能够为不结球白菜基因组学提供基础材料，能够应用于改良和进化不结球白菜的品种性状。我们要做的就是运用各种方法去实验得到日趋完整的不结球白菜突变体库。其中农杆菌介导法是白菜当中运用最广且成本较低的一种遗传转化技术。在双子叶植物和单子叶植物均有不同程度的研究，起初农杆菌介导法只用于双子叶植物的转化，在技术日益更新之后，单子叶植物的遗传转化也开始通过农杆菌来实现，例如水稻的转化[2]。农杆菌分为根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens,At）Ti质粒介导和发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes,Ar）Ri质粒介导的转化。根癌农杆菌和发根农杆菌同属农杆菌科。寄主范围十分广泛。它们在自然状态下可以通过伤口侵染植物，并通过它们分别具有的Ti质粒和Ri质粒上的转移DNA片段（transferred DNA,TDNA）转入植物细胞中，分别导致冠瘿瘤和毛状根的发生。Ti质粒和Ri质粒上只有两个区段是TDNA转移所必须的，即Vir区和TDNA的边界序列，TDNA编码的所有基因可以用人们所需的目的基因取代，而不影响其转移过程[3]。
目前这两种农杆菌均已在植物遗传转化中得到利用。而利用发根农杆菌进行植物转化成功的没有根癌农杆菌的多。其具体应用主要在于促进生根，增强抗逆性，次生
代谢产物生产等作用。它的作用在植物育种上有进一步开发的价值。有专家分别利用发根农杆菌和根癌农杆菌对甘蓝型油菜进行转化结果显示，前者转化频率比后者低。但是发根农杆菌也有其又是，它产生的毛状根较容易再生植株，且其毛状根为单细胞起源，由它产生的转化植株多为纯合体。农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有一段TDNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将TDNA插入到植物基因组中。因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。人们将目的基因插入到经过改造的TDNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中，近年来，农杆菌介导转化在一些单子叶植物（尤其是水稻）中也得到了广泛应用[4]。而本实验则参考农杆菌侵染的方法，对不结球白菜进行植株转化，最后得到了实验数据。
1 材料与方法
1.1 材料准备
本实验材料选择不结球白菜‘49菜心’，挑选优良的49菜心种子作实验待用（种子的品质十分重要，如果种子内部有内生菌，将会极易污染，灭菌步骤只能灭掉种子表面的菌类）。材料的准备主要有：外植体的准备、农杆菌LBA4404的制备[5]。
1. 1.1 外植体的准备 将苗龄为45天的无菌苗子叶、子叶柄（沿生长点切下，不包括生长点），下胚轴剪切下来。
1. 1.2 农杆菌LBA4404的培养 划线携带载体的LBA4404菌株于23个 包含100 μg/ml rifampicin和50 μg/ml kanamycin 的LB平板上。28 ℃孵育2 d。从平板上挑取单克隆置于10 ml包含有100 μg/ml rifampicin和50 μg/ kanamycin的YEB液体培养基中，28 ℃震荡（260 r.p.m）培养36 h。使用分光光度计测量OD600。最后将农杆菌离心下来，43005500 g，室温，10 min。弃掉液体，用液体MS培养基（不含抗生素）重悬沉淀。重复清晰一次，4300 g，室温离心10 min。用液体MS培养液重悬沉淀，并用起调正菌液OD600至0.40.5。农杆菌转入激活标记载体pSK1015[6]，如图1。
1.2 外植体的培养以及农杆菌侵染外植体[7]
1. 2.1 种子的消毒萌发和外植体的培养 （1）种子消毒：将种子置于消过毒的100 ml的烧杯中，加入大约25 ml左右的酒精，处理30 s后，将酒精倒掉，留下种子。加入2030 ml的5 %次氯酸钠溶液 ，盖上封口膜，缓慢晃动并消毒15 min左右。弃掉次氯酸钠溶液，用灭过菌的蒸馏水清洗种子约5 次，每次加入2535 ml的蒸馏水晃动约30 s（在通风橱内操作）。将种子倒在消过毒的培养皿内，待用。（2）种子萌发：用镊子将灭过菌的种子转移到包含种子萌发培养基的平板上，每板约20 粒种子。室温，黑暗中（黑暗或弱光更易转化成功）培养1 d，然后光周期12 h，培养3 d。（3）外植体预培养：将幼苗从萌芽培养基中取出，置于空的培养皿上。用消过毒的锋利的手术刀把子叶切下（包含2 mm左右的叶柄，但不包括生长点）。将外植体转移到预培养基上，避免外植体失水。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 材料准备 2
1.2 外植体的制备以及农杆菌侵染外植体2
1.2.1 外植体的制备2
1.2.2 农杆菌的制备3
1.2.3 芽、根的诱导和筛选转化3
1.2.4 温室驯化及移栽3
2 结果分析4
2.1 设计得到含有激活标记质粒PSKI015的引物4
2.2 PCR测定与植株统计分析4
3 讨论 5
3.1组培法侵染不结球白菜的优缺点5
3.2农杆菌菌株和载体5
3.3激活标签技术的运用对于本实验的影响 5
3.4 建立不结球白菜突变体库的意义 5
致谢6
参考文献6
图1农杆菌介导的通过组织培养途径的不结球白菜转化3
图2通过以抗除草剂Basta为筛选标记的含有激活标记质粒pSK1015的农杆菌转化4
图3 PCR测定得到的结果4
图4 转化后菜心植株的表型5
表1 实验植株的统计数据5
农杆菌介导法的不结球白菜突变体库的建立
引言
不结球白菜突变体库的建立是一个庞大的 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
工程，不结球白菜突变体库的构建能够为不结球白菜基因组学提供基础材料，能够应用于改良和进化不结球白菜的品种性状。我们要做的就是运用各种方法去实验得到日趋完整的不结球白菜突变体库。其中农杆菌介导法是白菜当中运用最广且成本较低的一种遗传转化技术。在双子叶植物和单子叶植物均有不同程度的研究，起初农杆菌介导法只用于双子叶植物的转化，在技术日益更新之后，单子叶植物的遗传转化也开始通过农杆菌来实现，例如水稻的转化[2]。农杆菌分为根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens,At）Ti质粒介导和发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes,Ar）Ri质粒介导的转化。根癌农杆菌和发根农杆菌同属农杆菌科。寄主范围十分广泛。它们在自然状态下可以通过伤口侵染植物，并通过它们分别具有的Ti质粒和Ri质粒上的转移DNA片段（transferred DNA,TDNA）转入植物细胞中，分别导致冠瘿瘤和毛状根的发生。Ti质粒和Ri质粒上只有两个区段是TDNA转移所必须的，即Vir区和TDNA的边界序列，TDNA编码的所有基因可以用人们所需的目的基因取代，而不影响其转移过程[3]。
目前这两种农杆菌均已在植物遗传转化中得到利用。而利用发根农杆菌进行植物转化成功的没有根癌农杆菌的多。其具体应用主要在于促进生根，增强抗逆性，次生
代谢产物生产等作用。它的作用在植物育种上有进一步开发的价值。有专家分别利用发根农杆菌和根癌农杆菌对甘蓝型油菜进行转化结果显示，前者转化频率比后者低。但是发根农杆菌也有其又是，它产生的毛状根较容易再生植株，且其毛状根为单细胞起源，由它产生的转化植株多为纯合体。农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有一段TDNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将TDNA插入到植物基因组中。因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。人们将目的基因插入到经过改造的TDNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中，近年来，农杆菌介导转化在一些单子叶植物（尤其是水稻）中也得到了广泛应用[4]。而本实验则参考农杆菌侵染的方法，对不结球白菜进行植株转化，最后得到了实验数据。
1 材料与方法
1.1 材料准备
本实验材料选择不结球白菜‘49菜心’，挑选优良的49菜心种子作实验待用（种子的品质十分重要，如果种子内部有内生菌，将会极易污染，灭菌步骤只能灭掉种子表面的菌类）。材料的准备主要有：外植体的准备、农杆菌LBA4404的制备[5]。
1. 1.1 外植体的准备 将苗龄为45天的无菌苗子叶、子叶柄（沿生长点切下，不包括生长点），下胚轴剪切下来。
1. 1.2 农杆菌LBA4404的培养 划线携带载体的LBA4404菌株于23个 包含100 μg/ml rifampicin和50 μg/ml kanamycin 的LB平板上。28 ℃孵育2 d。从平板上挑取单克隆置于10 ml包含有100 μg/ml rifampicin和50 μg/ kanamycin的YEB液体培养基中，28 ℃震荡（260 r.p.m）培养36 h。使用分光光度计测量OD600。最后将农杆菌离心下来，43005500 g，室温，10 min。弃掉液体，用液体MS培养基（不含抗生素）重悬沉淀。重复清晰一次，4300 g，室温离心10 min。用液体MS培养液重悬沉淀，并用起调正菌液OD600至0.40.5。农杆菌转入激活标记载体pSK1015[6]，如图1。
1.2 外植体的培养以及农杆菌侵染外植体[7]
1. 2.1 种子的消毒萌发和外植体的培养 （1）种子消毒：将种子置于消过毒的100 ml的烧杯中，加入大约25 ml左右的酒精，处理30 s后，将酒精倒掉，留下种子。加入2030 ml的5 %次氯酸钠溶液 ，盖上封口膜，缓慢晃动并消毒15 min左右。弃掉次氯酸钠溶液，用灭过菌的蒸馏水清洗种子约5 次，每次加入2535 ml的蒸馏水晃动约30 s（在通风橱内操作）。将种子倒在消过毒的培养皿内，待用。（2）种子萌发：用镊子将灭过菌的种子转移到包含种子萌发培养基的平板上，每板约20 粒种子。室温，黑暗中（黑暗或弱光更易转化成功）培养1 d，然后光周期12 h，培养3 d。（3）外植体预培养：将幼苗从萌芽培养基中取出，置于空的培养皿上。用消过毒的锋利的手术刀把子叶切下（包含2 mm左右的叶柄，但不包括生长点）。将外植体转移到预培养基上，避免外植体失水。
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