梨pynac基因的功能验证
根据梨基因组注释及序列比对找到梨的NAC基因Pbr024863.1，命名为pyNAC。其具有NAC的典型结构域，属于与细胞分裂相关NAM家族。因此推测pyNAC基因有可能调控果实发育中的细胞分裂，影响果实的纵径和横径，从而影响果实的最终大小。为了验证这一功能，运用序列扩增法成功克隆了梨的pyNAC基因，构建过量载体pCAMBIA1301-pyNAC，通过农杆菌转化法，将其转入模式植物Micro-Tom番茄，成功转化并得到再生植物。通过观察对比T1代转基因番茄植株和野生番茄植株的性状，发现梨pyNAC基因不是影响梨果实大小的关键因素，而对植株的营养生长起到重要作用。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1.1 植物材料 2
1.2 质粒 2
1.3 带有目的基因pyNAC番茄遗传转化方法 3
1.4 转基因番茄阳性苗的生根培养和移栽 4
1.5 性状观察和数据统计 5
2 结果与分析 6
2.1 果实大小比较 6
2.2 植株营养生长情况比较 6
2.3 结论 7
3 讨论 7
3.1 梨pyNAC基因对果实大小的影响 7
3.2 梨 pyNAC基因对营养生长的影响 7
3.2 尚待深入研究和解决的问题 8
致谢 8
参考文献 8
附录：原始数据 9
梨pyNAC基因的功能验证
引言
梨是一种落叶乔木，属于蔷薇科(Rosaceae)，梨亚科(Pomaceae)，梨属(Pyrus L.)。世界上梨属植物广泛分布于欧洲、亚洲、北美洲及南半球温带地区，总共约有60余种，其中原产我国的有13个种[1]。国内梨的其栽培面积和产量位居第三位，仅次于柑橘和苹果[2]，且我国梨的生产总量、栽培面积和出口量均居世界首位[3]。梨的口感绝佳，具有高纤维，低卡路里且富含维他命和矿物质，是一种广受消费者欢迎的高营养水果。 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
梨果实大小是梨生产和销售过程中的重要特征，特别实在中国和日本市场，较大的商品梨更受消费者的欢迎，与此同时梨果实大小也是决定其果实品质的重要因素，因此培育大果型的梨具有更高的经济效益[4]。梨果实的大小除了与授粉、套袋、肥水条件、生长调节剂等栽培管理因素相关外，遗传因素是决定梨果实大小的重要因素。由于多基因控制梨果实大小的性状，因此研究控制梨果实大小的关键基因有利于从分子遗传水平改善梨果实品质，从而推动梨产业发展。
NAC转录因子在植物中广泛分布并且作为首屈一指的转录因子家族，从苔鲜植物到高等双子叶植物都能找到其身影，其数量和种类十分庞大。研究表明，NAC转录因子功能繁多且强大，在植物次生生长、激素调控和信号转导、植株衰老、细胞分裂、防御反应、矿质元素营养和农作物品质改良等进程中都发挥着作用。除此之外有大量的证据表明，在病原体侵染植物体造成生物损伤或者面临低温、干旱、高盐、ABA和机械损伤等情况下，NAC转录因子还可以通过激活或抑制植物体目标基因的表达，调控植物非生物胁迫的应答过程[5]。
在以往的研究中，梨pyNAC基因在‘砀山酥梨’果实发育过程发挥作用，pyNAC基因的表达情况与果实的纵径、横径及单果重形状的变化特征之间存在着一定的联系。相关性分析表明，梨pyNAC基因的表达与果实纵径发育的变化的相关系数为0.737，与果实横径的相关系数为0.761，与单果重的相关系数为0.590，说明pyNAC基因可能与梨果实的纵径、横径和单果重性状有关，特别是梨果实的纵径和横径性状[6]。pyNAC属于与细胞分裂相关的NAM亚组，因此推测pyNAC有可能调控果实发育中的细胞分裂，影响果实的纵径和横径，从而影响果实的最终大小。
在此理论基础上，对梨pyNAC基因这一功能进行验证和进一步探索，而转基因技术无疑是探究基因功能的有效方法[7]。通过提取目的基因或者将人工合的DNA片段转入特定生物中，与特定生物本身的基因组进行重组并进行人工筛选，使转基因生物获得具有特定表现的，稳定的遗传性状，从而对某一基因的具体功能进行研究。本试验采用农杆菌介导转化这一普遍适用且转化效率较高的植物转基因的操作方法，农杆菌是一种革兰氏阴性细菌，普遍存在于土壤之中。根癌农杆菌中细胞中含有Ti质粒，发根农杆菌细胞中含有Ri质粒，其上皆有一段TDNA。在自然条件下，农杆菌能趋化性地感染植物的受伤部位然后进入植物细胞，从而将TDNA插入到植物基因组中。根据这一特性，人们将目的基因插入农杆菌质粒内经过改造的TDNA区，通过农杆菌的侵染，将外源基因转移并整合到植物细胞中[8]，最后通过组织培养培育出转基因植株。本试验利用已有的农杆菌构建的表达载体pCAMBIA1301pyNAC，感染模式植物MicroTom番茄的受伤部位，诱导产生不定芽[9]，通过进一步筛选和培育，观察并分析统计T1代选育植株的果实的纵径和横径，验证pyNAC基因是否与果实大小相关，并在此基础上进一步探究梨pyNAC基因的功能。
1 材料与方法
1.1 植物材料
MicroTom番茄种子
1.2 质粒
质粒pCAMBIA1301，为本实验所使用的表达载体（图1）。
/
图1 pCAMBIA1301载体结构图
Fig.1 Structure of pCAMBIA1301 vector
1.3 带有目的基因pyNAC番茄遗传转化方法
1.3.1 MicroTom番茄组培苗的获取
用70%乙醇处理MicroTom番茄种子30秒，紧接着用无菌水洗涤3遍，再用2.5%次氯酸钠溶液处理5分钟，最后再用无菌水洗涤4遍。用镊子夹取种子置于M1萌发培养基上，调节生长温度为25℃，光周期条件为16h与8h黑暗相互交替，培养约14天左右。
等到MicroTom番茄子叶完全展开第一片真叶露心时，切下子叶，垂直于主脉横切1—2刀，正面朝上置于M2预培养培养基上，再盖一张小滤纸，黑暗培养1天。
1.3.2 农杆菌侵染液的制备
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1.1 植物材料 2
1.2 质粒 2
1.3 带有目的基因pyNAC番茄遗传转化方法 3
1.4 转基因番茄阳性苗的生根培养和移栽 4
1.5 性状观察和数据统计 5
2 结果与分析 6
2.1 果实大小比较 6
2.2 植株营养生长情况比较 6
2.3 结论 7
3 讨论 7
3.1 梨pyNAC基因对果实大小的影响 7
3.2 梨 pyNAC基因对营养生长的影响 7
3.2 尚待深入研究和解决的问题 8
致谢 8
参考文献 8
附录：原始数据 9
梨pyNAC基因的功能验证
引言
梨是一种落叶乔木，属于蔷薇科(Rosaceae)，梨亚科(Pomaceae)，梨属(Pyrus L.)。世界上梨属植物广泛分布于欧洲、亚洲、北美洲及南半球温带地区，总共约有60余种，其中原产我国的有13个种[1]。国内梨的其栽培面积和产量位居第三位，仅次于柑橘和苹果[2]，且我国梨的生产总量、栽培面积和出口量均居世界首位[3]。梨的口感绝佳，具有高纤维，低卡路里且富含维他命和矿物质，是一种广受消费者欢迎的高营养水果。 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
梨果实大小是梨生产和销售过程中的重要特征，特别实在中国和日本市场，较大的商品梨更受消费者的欢迎，与此同时梨果实大小也是决定其果实品质的重要因素，因此培育大果型的梨具有更高的经济效益[4]。梨果实的大小除了与授粉、套袋、肥水条件、生长调节剂等栽培管理因素相关外，遗传因素是决定梨果实大小的重要因素。由于多基因控制梨果实大小的性状，因此研究控制梨果实大小的关键基因有利于从分子遗传水平改善梨果实品质，从而推动梨产业发展。
NAC转录因子在植物中广泛分布并且作为首屈一指的转录因子家族，从苔鲜植物到高等双子叶植物都能找到其身影，其数量和种类十分庞大。研究表明，NAC转录因子功能繁多且强大，在植物次生生长、激素调控和信号转导、植株衰老、细胞分裂、防御反应、矿质元素营养和农作物品质改良等进程中都发挥着作用。除此之外有大量的证据表明，在病原体侵染植物体造成生物损伤或者面临低温、干旱、高盐、ABA和机械损伤等情况下，NAC转录因子还可以通过激活或抑制植物体目标基因的表达，调控植物非生物胁迫的应答过程[5]。
在以往的研究中，梨pyNAC基因在‘砀山酥梨’果实发育过程发挥作用，pyNAC基因的表达情况与果实的纵径、横径及单果重形状的变化特征之间存在着一定的联系。相关性分析表明，梨pyNAC基因的表达与果实纵径发育的变化的相关系数为0.737，与果实横径的相关系数为0.761，与单果重的相关系数为0.590，说明pyNAC基因可能与梨果实的纵径、横径和单果重性状有关，特别是梨果实的纵径和横径性状[6]。pyNAC属于与细胞分裂相关的NAM亚组，因此推测pyNAC有可能调控果实发育中的细胞分裂，影响果实的纵径和横径，从而影响果实的最终大小。
在此理论基础上，对梨pyNAC基因这一功能进行验证和进一步探索，而转基因技术无疑是探究基因功能的有效方法[7]。通过提取目的基因或者将人工合的DNA片段转入特定生物中，与特定生物本身的基因组进行重组并进行人工筛选，使转基因生物获得具有特定表现的，稳定的遗传性状，从而对某一基因的具体功能进行研究。本试验采用农杆菌介导转化这一普遍适用且转化效率较高的植物转基因的操作方法，农杆菌是一种革兰氏阴性细菌，普遍存在于土壤之中。根癌农杆菌中细胞中含有Ti质粒，发根农杆菌细胞中含有Ri质粒，其上皆有一段TDNA。在自然条件下，农杆菌能趋化性地感染植物的受伤部位然后进入植物细胞，从而将TDNA插入到植物基因组中。根据这一特性，人们将目的基因插入农杆菌质粒内经过改造的TDNA区，通过农杆菌的侵染，将外源基因转移并整合到植物细胞中[8]，最后通过组织培养培育出转基因植株。本试验利用已有的农杆菌构建的表达载体pCAMBIA1301pyNAC，感染模式植物MicroTom番茄的受伤部位，诱导产生不定芽[9]，通过进一步筛选和培育，观察并分析统计T1代选育植株的果实的纵径和横径，验证pyNAC基因是否与果实大小相关，并在此基础上进一步探究梨pyNAC基因的功能。
1 材料与方法
1.1 植物材料
MicroTom番茄种子
1.2 质粒
质粒pCAMBIA1301，为本实验所使用的表达载体（图1）。
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图1 pCAMBIA1301载体结构图
Fig.1 Structure of pCAMBIA1301 vector
1.3 带有目的基因pyNAC番茄遗传转化方法
1.3.1 MicroTom番茄组培苗的获取
用70%乙醇处理MicroTom番茄种子30秒，紧接着用无菌水洗涤3遍，再用2.5%次氯酸钠溶液处理5分钟，最后再用无菌水洗涤4遍。用镊子夹取种子置于M1萌发培养基上，调节生长温度为25℃，光周期条件为16h与8h黑暗相互交替，培养约14天左右。
等到MicroTom番茄子叶完全展开第一片真叶露心时，切下子叶，垂直于主脉横切1—2刀，正面朝上置于M2预培养培养基上，再盖一张小滤纸，黑暗培养1天。
1.3.2 农杆菌侵染液的制备
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