凹土对受PAEs污染土壤中蚯蚓AchE活性以及蛋白质含量的影响
目 录
1 引言 1
1.1 酞酸酯的污染现状 1
1.2 蚯蚓作为生物指标在分子生态毒理学评价中的应用简介 2
1.3 凹土的性质及在环境领域的应用 3
1.5 研究内容与研究意义 3
2 实验部分 4
2.1 实验材料 4
2.2 实验设计 5
2.3 蚯蚓体内蛋白质含量测定分析方法 6
2.4 蚯蚓体内乙酰胆碱酯酶活性测定方法分析 6
3 结果与讨论 7
3.1 酞酸酯对乙酰胆碱酯酶活性影响 7
3.2 酞酸酯对蚯蚓体内蛋白质含量的影响 7
3.3 凹土对污染土壤中蚯蚓体内蛋白质含量的影响 8
3.4 凹土对污染土壤中蚯蚓体内AChE活性的影响 9
结 论 12
致 谢 13
参 考 文 献 14
1 引言
1.1 酞酸酯的污染现状
1.1.1 酞酸酯类物质
酞酸酯( Phthalate esters,PAEs) ，是人工合成的有机化合物，又名邻苯二甲酸酯，主要用作塑料、橡胶等的增塑和软化，像用于粘合剂、油漆、聚氯乙烯等产品生产的邻苯二甲酸(2-乙基己基)酷(DEHP)、邻苯二甲酸二丁酷(DBP)和邻苯二甲酸丁基节基酷(BBP)。由于比其他增塑剂化学稳定性好，生产工艺简单，原料便宜易得成本低廉，因此广泛运用于建筑住宅装修和汽车制造行业，并且在如洗发剂、香皂、化妆等日用化学品中也都普遍含有领苯二酸乙酯（DEP）。在过去，人们一直以为PAEs是低毒性化合物从而无限制地生产，80年代以来，随着国内外有关PAEs环境污染问题的报道日见 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
增多，PAEs环境安全问题已成为环境科学鼓励研究领域[1]。
1.1.2 PAEs的污染现状
随着世界经济的发展，各国对增塑剂的需求增加，PAEs产量也逐年递增，近年来，PAEs对土壤的污染己引起全球的广泛重视，由于人类社会的大量生产和广泛使用，PAEs已成为地球上最广泛存在的环境污染物之一，目前在全球许多地区的大气悬浮物和沉降物，水体、土壤和底泥中均能检测到PAEs污染物的存在，PAEs已对全球大气、土壤、水体造成一定污染[2-6]扰乱生态平衡。
塑料包装材料、纤维、涂料和油漆的使用，塑料垃圾的焚烧和农用薄膜中增塑剂的挥发以及PAEs污染的水体和土壤都可使PAEs进入大气环境。PAEs对大气的污染主要来自工业排放，在大气中主要是附着于大气颗类物，目前世界各地大气均被检出含有不同程度的PAEs，足已证明此类化合物对大气□污染相当普遍。
土壤是PAEs积累和迁移的重要介质，该类化合物经挥发、沉降、吸附脱附过程在大气、水体、土壤环境中迁移转化。土壤中的PAEs能通过生物和非生物降解，挥发向环境输出，塑料地膜中的PAEs容易渗出吸附于土壤和沉积物，目前我国塑料地膜产量和覆盖面积稳居世界第一，对我国农田土壤造成了很大危害。
水资源是人类赖以生存的的重要组成部分，水的污染及其防治问题已引起了世界各国政府与公众的关注。国内外有很多报道在水环境中检测到PAEs，说明世界各地的水体已受到不同程度的PAEs污染，对水环境构成了一定的潜在生态风险危害。国外已将PAEs称为“第二个全球性的PCB污染物”。目前我国水环境中广泛存在PAEs，对淡水资源和海洋生态系统已造成了一定影响，且其污染逐年加重。根据中国环境检测中心，DEP、DBP、DOP已被列为中国水资源优先污染物的黑名单[7]。
1.2 蚯蚓作为生物指标在分子生态毒理学评价中的应用简介
1.2.1 蚯蚓在生态毒理学评价中的意义和测试方法
在土壤生态系统中广泛分布着陆栖土壤无脊椎动物，它们是土壤动物的主要种类,其中蚯蚓占土壤的总生物量份额最大，是生态系统的一个重要组成部分。蚯蚓培养简单，生物信息丰富，通过其身体表面接触土壤及消化系统来消化被污染的食物，从而以表皮和口两个途径接触污染土壤，使蚯蚓可以直接暴露于土壤中污染物，对受污染的土壤感应敏感性良好，能准确反映土壤污染情况。因此，蚯蚓常作为土壤污染的指示生物，来评价土壤环境质量。太平二号蚯蚓价格实惠又易于饲养,且因蚯蚓种的生活周期短，繁殖能力强，现已被公认成为最广泛的模式供试物种[8]，常用来进行生态毒理试验。
蚯蚓作为生态毒理检测的模式生物，现已建立了比较完善的标准试验方法，经济合作与发展组织(Organization for Economic Cooperation and Development,OECD)指南[9-10]和国际标准组织(International Organization fcr Standardization,ISO) [11]，对蚯蚓的急性毒性、亚急性毒性、慢性毒性试验和再生试验方法做了详细的标准化规则。这些试验方法在试验的标准化程度、方便和可操作性，结果的准确性等方面各有优缺点，其中对有毒化学品的急性毒性测试方法有滤纸接触法(contact filter paper test)，人工土壤试验法(Artificial soil test)和人造土壤试验法(Artsoltest)，滤纸接触法是指实验动物经过皮肤接触化学品，在试验时间内观察化学品对实验动物的行为形态影响，测定死亡率，以此来评价此种化学品的生物毒性，试验时间一般为48 h或72 h，其特点是简单，快速易行，缺点是仅能得出通过皮肤接触所产生的毒性信息。土壤试验法是尽量模拟一个蛇顿真实的生活环境，试验时间为14 d，其优点是可以尽可能真实地反映有毒化学品在自然界中的影响。
1.2.2 蚯蚓在生态毒理学评价中的生物标记物
土壤的生态功能能够通过蚯蚓的生命活动、分子或代谢水平的变化直接或间接反应出来，因此，蚯蚓可以用于判定土壤污染状况，检测环境质量。蚯蚓生物标志物能敏感准确地揭示土壤污染物的暴露和效应，有些标志物可客观判断混合污染的复合效应，而化学检测方法是几乎不能做到这些的，因此,蚯蚓生物标志物这一领域研究日益受到研究者的重视，现已取得了引人注目的进展。当蚯蚓受到土壤中污染物胁迫时,在细胞、分子和生理水平上都会发生明显的变化，进而影响其存活、生长和繁殖能力,最终引起种群及群落的变化，因此蚯蚓的生物反应指标可以是个体或种群和群落，也可以是在细胞或分子水平上，如存活率、繁殖率[12]、行为反应、生长率和呼吸强度[13]、蚯蚓对有毒物质的体内富集和土壤残留、解毒酶系的变化[14]、解毒蛋白的变化[15]、蚯蚓体腔细胞溶酶体膜稳定性的变化[16]、基因水平的变化[17]等。
乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase ,AChE)是一种存在于人类和动物中枢神经系统中的丝氨酸水解酶，它在神经信号传导中起着重要作用。AChE可以催化神经递质乙酷胆碱水解为胆碱和乙酸。当AChE被抑制，乙酰胆碱过量会终止神经传递对突触后膜的刺激，并扰乱机体内正常的神经传导信号分子。当污染物扰乱正常机体功能时，AChE是评价污染物对神经系统毒害作用的最有效和快速的方法，所以AChE被广泛应用于评估环境污染物。已有文献表明：乙酰胆碱酯酶对外界环境条件变化较为敏感，可用以表征环境毒理效应，在环境毒理学研究中受到越来越多的关注[18]。因此，研究PAEs对蚯蚓组织酶活的毒性作用及其毒性机理具有十分重要的理论和实践意义。
1 引言 1
1.1 酞酸酯的污染现状 1
1.2 蚯蚓作为生物指标在分子生态毒理学评价中的应用简介 2
1.3 凹土的性质及在环境领域的应用 3
1.5 研究内容与研究意义 3
2 实验部分 4
2.1 实验材料 4
2.2 实验设计 5
2.3 蚯蚓体内蛋白质含量测定分析方法 6
2.4 蚯蚓体内乙酰胆碱酯酶活性测定方法分析 6
3 结果与讨论 7
3.1 酞酸酯对乙酰胆碱酯酶活性影响 7
3.2 酞酸酯对蚯蚓体内蛋白质含量的影响 7
3.3 凹土对污染土壤中蚯蚓体内蛋白质含量的影响 8
3.4 凹土对污染土壤中蚯蚓体内AChE活性的影响 9
结 论 12
致 谢 13
参 考 文 献 14
1 引言
1.1 酞酸酯的污染现状
1.1.1 酞酸酯类物质
酞酸酯( Phthalate esters,PAEs) ，是人工合成的有机化合物，又名邻苯二甲酸酯，主要用作塑料、橡胶等的增塑和软化，像用于粘合剂、油漆、聚氯乙烯等产品生产的邻苯二甲酸(2-乙基己基)酷(DEHP)、邻苯二甲酸二丁酷(DBP)和邻苯二甲酸丁基节基酷(BBP)。由于比其他增塑剂化学稳定性好，生产工艺简单，原料便宜易得成本低廉，因此广泛运用于建筑住宅装修和汽车制造行业，并且在如洗发剂、香皂、化妆等日用化学品中也都普遍含有领苯二酸乙酯（DEP）。在过去，人们一直以为PAEs是低毒性化合物从而无限制地生产，80年代以来，随着国内外有关PAEs环境污染问题的报道日见 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
增多，PAEs环境安全问题已成为环境科学鼓励研究领域[1]。
1.1.2 PAEs的污染现状
随着世界经济的发展，各国对增塑剂的需求增加，PAEs产量也逐年递增，近年来，PAEs对土壤的污染己引起全球的广泛重视，由于人类社会的大量生产和广泛使用，PAEs已成为地球上最广泛存在的环境污染物之一，目前在全球许多地区的大气悬浮物和沉降物，水体、土壤和底泥中均能检测到PAEs污染物的存在，PAEs已对全球大气、土壤、水体造成一定污染[2-6]扰乱生态平衡。
塑料包装材料、纤维、涂料和油漆的使用，塑料垃圾的焚烧和农用薄膜中增塑剂的挥发以及PAEs污染的水体和土壤都可使PAEs进入大气环境。PAEs对大气的污染主要来自工业排放，在大气中主要是附着于大气颗类物，目前世界各地大气均被检出含有不同程度的PAEs，足已证明此类化合物对大气□污染相当普遍。
土壤是PAEs积累和迁移的重要介质，该类化合物经挥发、沉降、吸附脱附过程在大气、水体、土壤环境中迁移转化。土壤中的PAEs能通过生物和非生物降解，挥发向环境输出，塑料地膜中的PAEs容易渗出吸附于土壤和沉积物，目前我国塑料地膜产量和覆盖面积稳居世界第一，对我国农田土壤造成了很大危害。
水资源是人类赖以生存的的重要组成部分，水的污染及其防治问题已引起了世界各国政府与公众的关注。国内外有很多报道在水环境中检测到PAEs，说明世界各地的水体已受到不同程度的PAEs污染，对水环境构成了一定的潜在生态风险危害。国外已将PAEs称为“第二个全球性的PCB污染物”。目前我国水环境中广泛存在PAEs，对淡水资源和海洋生态系统已造成了一定影响，且其污染逐年加重。根据中国环境检测中心，DEP、DBP、DOP已被列为中国水资源优先污染物的黑名单[7]。
1.2 蚯蚓作为生物指标在分子生态毒理学评价中的应用简介
1.2.1 蚯蚓在生态毒理学评价中的意义和测试方法
在土壤生态系统中广泛分布着陆栖土壤无脊椎动物，它们是土壤动物的主要种类,其中蚯蚓占土壤的总生物量份额最大，是生态系统的一个重要组成部分。蚯蚓培养简单，生物信息丰富，通过其身体表面接触土壤及消化系统来消化被污染的食物，从而以表皮和口两个途径接触污染土壤，使蚯蚓可以直接暴露于土壤中污染物，对受污染的土壤感应敏感性良好，能准确反映土壤污染情况。因此，蚯蚓常作为土壤污染的指示生物，来评价土壤环境质量。太平二号蚯蚓价格实惠又易于饲养,且因蚯蚓种的生活周期短，繁殖能力强，现已被公认成为最广泛的模式供试物种[8]，常用来进行生态毒理试验。
蚯蚓作为生态毒理检测的模式生物，现已建立了比较完善的标准试验方法，经济合作与发展组织(Organization for Economic Cooperation and Development,OECD)指南[9-10]和国际标准组织(International Organization fcr Standardization,ISO) [11]，对蚯蚓的急性毒性、亚急性毒性、慢性毒性试验和再生试验方法做了详细的标准化规则。这些试验方法在试验的标准化程度、方便和可操作性，结果的准确性等方面各有优缺点，其中对有毒化学品的急性毒性测试方法有滤纸接触法(contact filter paper test)，人工土壤试验法(Artificial soil test)和人造土壤试验法(Artsoltest)，滤纸接触法是指实验动物经过皮肤接触化学品，在试验时间内观察化学品对实验动物的行为形态影响，测定死亡率，以此来评价此种化学品的生物毒性，试验时间一般为48 h或72 h，其特点是简单，快速易行，缺点是仅能得出通过皮肤接触所产生的毒性信息。土壤试验法是尽量模拟一个蛇顿真实的生活环境，试验时间为14 d，其优点是可以尽可能真实地反映有毒化学品在自然界中的影响。
1.2.2 蚯蚓在生态毒理学评价中的生物标记物
土壤的生态功能能够通过蚯蚓的生命活动、分子或代谢水平的变化直接或间接反应出来，因此，蚯蚓可以用于判定土壤污染状况，检测环境质量。蚯蚓生物标志物能敏感准确地揭示土壤污染物的暴露和效应，有些标志物可客观判断混合污染的复合效应，而化学检测方法是几乎不能做到这些的，因此,蚯蚓生物标志物这一领域研究日益受到研究者的重视，现已取得了引人注目的进展。当蚯蚓受到土壤中污染物胁迫时,在细胞、分子和生理水平上都会发生明显的变化，进而影响其存活、生长和繁殖能力,最终引起种群及群落的变化，因此蚯蚓的生物反应指标可以是个体或种群和群落，也可以是在细胞或分子水平上，如存活率、繁殖率[12]、行为反应、生长率和呼吸强度[13]、蚯蚓对有毒物质的体内富集和土壤残留、解毒酶系的变化[14]、解毒蛋白的变化[15]、蚯蚓体腔细胞溶酶体膜稳定性的变化[16]、基因水平的变化[17]等。
乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase ,AChE)是一种存在于人类和动物中枢神经系统中的丝氨酸水解酶，它在神经信号传导中起着重要作用。AChE可以催化神经递质乙酷胆碱水解为胆碱和乙酸。当AChE被抑制，乙酰胆碱过量会终止神经传递对突触后膜的刺激，并扰乱机体内正常的神经传导信号分子。当污染物扰乱正常机体功能时，AChE是评价污染物对神经系统毒害作用的最有效和快速的方法，所以AChE被广泛应用于评估环境污染物。已有文献表明：乙酰胆碱酯酶对外界环境条件变化较为敏感，可用以表征环境毒理效应，在环境毒理学研究中受到越来越多的关注[18]。因此，研究PAEs对蚯蚓组织酶活的毒性作用及其毒性机理具有十分重要的理论和实践意义。
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