茶树花粉cse1α基因的启动子
本研究采用CTAB法提取茶树花粉基因组DNA，根据E1α基因的cDNA设计并合成引物，通过TAIL-PCR扩增得到一片段，并连接至pMD18-T Vector上进行克隆测序。结果表明，该片段全长898 bp，重叠区域与相关序列完全匹配。启动子片段长336 bp，含有2个CAAT-box，2个TATA-box，2个GATA-box，1个LTR，1个G-box等相关元件。本实验为进一步研究CsE1α基因的表达调控奠定基础。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.2 方法 2
1.2.1 茶树花粉基因组DNA的提取2
1.2.2 引物设计与及PCR扩增2
1.2.3 克隆与测序3
2 结果与分析3
2.1 PCR产物鉴定3
2.2 序列测定及分析3
3 讨论 4
致谢5
参考文献5
图1 茶树花粉CsE1α基因的启动子克隆3
图2 重组子菌落的PCR检测4
图2 茶树花粉CsE1α基因启动子的序列分析4
茶树花粉CsE1α基因的启动子克隆及序列分析
引言
茶树（Camellia sinensis)是山茶科,山茶属的多年生木本常绿植物[1]。我国不仅有几千年的茶树栽培历史，还是最早栽培茶树的国家。我国茶区辽阔，地跨暖温带、亚热带、边缘热带[2]。我国茶树栽培范围，西自西藏自治区米林，东至台湾省东岸，南起海南岛榆林，北到山东荣城[3]。而在茶树的栽培过程中，寒害是一种常见的气候性灾害。寒冷作为一种外界环境因素，是生物进化过程中时时面对的一种外界应激；而这种寒冷应激显著影响细胞代谢、生长过程[4]。丙酮酸脱氢酶系（pyruvate dehydrogenase complex，PDC）是定位于线粒体的多酶复合体，是2氧(代)酸脱氢酶复合（OADHc）家族中的一员，广泛分布于动植物微生物体内。丙酮酸脱氢酶复合体是由丙酮酸脱氢酶(pyruvate dehydrogenase简称PD *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
H或E1)、二氢硫辛酸乙酰转移酶(dihydrolipoamide acetyltransferase简称E2)、二氢硫辛酸脱氢酶(dihydrolipoamide dehydrogenase简称E3)等组成[5]。在细胞代谢过程中，丙酮酸脱氢酶系占据关键的代谢位置，对能量代谢的影响意义重大。而PDCE1α基因是连接能量代谢途径的闸门,该基因如果出现异常势必影响整个能量代谢途径[6]。所以，在茶树抗寒的基因调控方面，对PDCE1α基因的调控可能会有一定的作用，但是具体方面仍待进一步的研究。侯丙凯等[7]指出，启动子是一段能与RNA聚合酶及其转录因子特异结合、决定基因转录起始的DNA序列，其类型直接影响着外源基因的表达量及表达位点。聂丽娜等[8]研究表明，植物基因启动子中包含多种重要的顺式作用元件，在转录水平上参与调控下游相应基因表达，从而使植物能够抵御外界环境胁迫。由此可见，对E1α基因的启动子进行分离与及分析清楚其分子本质是研究E1α基因调控机制的一项重要内容，也是构建基因表达载体的关键。近年来，也有不少关于PDCE1α基因的研究报道。例如，Yui等[9]利用反义技术把甜菜线粒体 PDCE1的部分序列(bvPDHE1α1)反方向与花药绒毡层特异启动子连接, 转入烟草中, 结果引起花药绒毡层内PDHc的活性不足而导致雄性不育,从而证实抑制 PDCE1α基因表达可引起雄性不育。这些报道大都是与雄性不育相关。关于E1α基因启动子的分子机理研究还较少，尤其在林木方面。
本研究拟通过分离克隆茶树花粉CsE1α基因的启动子，并对序列进行生物信息学分析，为下一步植物表达载体的构建，进一步研究CsE1α基因的表达调控奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
茶树花粉（取自中山陵茶场采摘的花蕾期花骨朵）；大肠杆菌受体菌株DH5α由本实验室保存；pMD18T Vector购自TaKaRa公司；普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自购自OMEGA公司。
1.2 方法
1.2.1 茶树花粉基因组DNA的提取：
CTAB法：65℃水浴锅中预热CTAB提取缓冲液至澄清；用液氮预冷小研钵，倒入0.3g花粉，快速研磨；向小研钵中加入0.8ml CTAB提取缓冲液，搅拌成糊状，倒入2ml离心管中，65℃水浴15min；加入等体积（约0.8ml）氯仿/异戊醇轻摇混匀，于10000 rpm离心5min；用100μl移液器小心吸取上清（注意不要吸入黄色中间层）至另一个新离心管中；重复上两步步骤；随后，加入2倍体积无水乙醇，上下颠倒数次，混匀后放入20℃沉淀15min以上；10000 rpm离心5min，弃上清；加入1ml预冷70%乙醇，10000 rpm离心5min，弃上清；加入1ml预冷无水乙醇，10000 rpm离心5min，弃上清；吸掉残余液体，将离心管放于通风橱吹干，加入适量（100μl）ddH2O溶解，置于20℃环境中保存备用。
1.2.2 引物设计与及PCR扩增
上游随机引物如下：
AD1 5TGWGNAGWANCASAGA3‘
AD2 5AGWGNAGWANCAWAGG3
AD3 5CAWCGICNGAIASGAA3‘
AD4 5NTCGASTWTSGWGTT3
AD5 5GTCGASWGANAWGAA3‘
AD6 5WGTGNAGWANCANAGA3。
下游引物设计原则：引物的长度为22~26 nt，GC含量45~55％，Tm值60~70℃。其他要求和普通PCR反应用引物相同。根据实验得到的相关序列（自主知识产权未登录），用Primer 5.0软件设计引物，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成的下游序列为：
GSP1 5GTGCCTTTAGGTTGTGGATTGG3
GSP2 5TTGGTTGGCTAGTGAGTCCTCT3
GSP3 5CCTGAGAAGTTGAAGGGTTTGG3
以茶树花粉基因组DNA为模板，以AD和GSP1为引物进行PCR扩增反应，反应体系为：模板DNA 1μL，dNTP Mixture（2.5mm each）8μL，10×LA PCR Buffer II（Mg2+ plus）5μL，TaKaRa LA Taq（5 U/μl）0.5μL，AD Primer（100pmol/μl）1μL，GSP1/GSP2/GSP3（10pmol/μl）1μL，ddH2O 33.5μL，总体积50μL。反应程序为：94℃变性1 min，再98℃ 1 min；紧接着5个循环为94℃ 30s， 68℃ 1 min，72℃ 2 min；接着94℃ 30s，25℃ 3 min，72℃ 2 min；然后按照（94℃ 30s，68℃ 1 min，72℃ 2 min）—（94℃ 30s，68℃ 1 min，72℃ 2 min）—（94℃ 30s，44℃ 1 min，72℃ 2 min）方向进行15个循环；最后72℃延伸10min。反应完成后，将上述PCR反应液稀释50倍作为第二轮PCR扩增模板。第二轮PCR反应：以AD和GSP2引物进行PCR扩增，反应程序为：按照（94℃ 30s，68℃ 1 min，72℃ 2 min）—（94℃ 30s，68℃ 1 min，72℃ 2 min）—（94℃ 30s，44℃ 1 min，72℃ 2 min）方向进行15个循环；最后72℃延伸10min。反应完成后，将上述PCR反应液稀释50倍作为第三轮PCR扩增模板。第三轮PCR反应：以AD和GSP3引物进行PCR扩增，反应程序为：按照（94℃ 30s，68℃ 1 min，72℃ 2 min）—（94℃ 30s，68℃ 1 min，72℃ 2 min）—（94℃ 30s，44℃ 1 min，72℃ 2 min）方向进行15个循环；最后72℃延伸10min。电泳、照相并切下目的条带回收，于20℃下保存备用。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.2 方法 2
1.2.1 茶树花粉基因组DNA的提取2
1.2.2 引物设计与及PCR扩增2
1.2.3 克隆与测序3
2 结果与分析3
2.1 PCR产物鉴定3
2.2 序列测定及分析3
3 讨论 4
致谢5
参考文献5
图1 茶树花粉CsE1α基因的启动子克隆3
图2 重组子菌落的PCR检测4
图2 茶树花粉CsE1α基因启动子的序列分析4
茶树花粉CsE1α基因的启动子克隆及序列分析
引言
茶树（Camellia sinensis)是山茶科,山茶属的多年生木本常绿植物[1]。我国不仅有几千年的茶树栽培历史，还是最早栽培茶树的国家。我国茶区辽阔，地跨暖温带、亚热带、边缘热带[2]。我国茶树栽培范围，西自西藏自治区米林，东至台湾省东岸，南起海南岛榆林，北到山东荣城[3]。而在茶树的栽培过程中，寒害是一种常见的气候性灾害。寒冷作为一种外界环境因素，是生物进化过程中时时面对的一种外界应激；而这种寒冷应激显著影响细胞代谢、生长过程[4]。丙酮酸脱氢酶系（pyruvate dehydrogenase complex，PDC）是定位于线粒体的多酶复合体，是2氧(代)酸脱氢酶复合（OADHc）家族中的一员，广泛分布于动植物微生物体内。丙酮酸脱氢酶复合体是由丙酮酸脱氢酶(pyruvate dehydrogenase简称PD *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
H或E1)、二氢硫辛酸乙酰转移酶(dihydrolipoamide acetyltransferase简称E2)、二氢硫辛酸脱氢酶(dihydrolipoamide dehydrogenase简称E3)等组成[5]。在细胞代谢过程中，丙酮酸脱氢酶系占据关键的代谢位置，对能量代谢的影响意义重大。而PDCE1α基因是连接能量代谢途径的闸门,该基因如果出现异常势必影响整个能量代谢途径[6]。所以，在茶树抗寒的基因调控方面，对PDCE1α基因的调控可能会有一定的作用，但是具体方面仍待进一步的研究。侯丙凯等[7]指出，启动子是一段能与RNA聚合酶及其转录因子特异结合、决定基因转录起始的DNA序列，其类型直接影响着外源基因的表达量及表达位点。聂丽娜等[8]研究表明，植物基因启动子中包含多种重要的顺式作用元件，在转录水平上参与调控下游相应基因表达，从而使植物能够抵御外界环境胁迫。由此可见，对E1α基因的启动子进行分离与及分析清楚其分子本质是研究E1α基因调控机制的一项重要内容，也是构建基因表达载体的关键。近年来，也有不少关于PDCE1α基因的研究报道。例如，Yui等[9]利用反义技术把甜菜线粒体 PDCE1的部分序列(bvPDHE1α1)反方向与花药绒毡层特异启动子连接, 转入烟草中, 结果引起花药绒毡层内PDHc的活性不足而导致雄性不育,从而证实抑制 PDCE1α基因表达可引起雄性不育。这些报道大都是与雄性不育相关。关于E1α基因启动子的分子机理研究还较少，尤其在林木方面。
本研究拟通过分离克隆茶树花粉CsE1α基因的启动子，并对序列进行生物信息学分析，为下一步植物表达载体的构建，进一步研究CsE1α基因的表达调控奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
茶树花粉（取自中山陵茶场采摘的花蕾期花骨朵）；大肠杆菌受体菌株DH5α由本实验室保存；pMD18T Vector购自TaKaRa公司；普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自购自OMEGA公司。
1.2 方法
1.2.1 茶树花粉基因组DNA的提取：
CTAB法：65℃水浴锅中预热CTAB提取缓冲液至澄清；用液氮预冷小研钵，倒入0.3g花粉，快速研磨；向小研钵中加入0.8ml CTAB提取缓冲液，搅拌成糊状，倒入2ml离心管中，65℃水浴15min；加入等体积（约0.8ml）氯仿/异戊醇轻摇混匀，于10000 rpm离心5min；用100μl移液器小心吸取上清（注意不要吸入黄色中间层）至另一个新离心管中；重复上两步步骤；随后，加入2倍体积无水乙醇，上下颠倒数次，混匀后放入20℃沉淀15min以上；10000 rpm离心5min，弃上清；加入1ml预冷70%乙醇，10000 rpm离心5min，弃上清；加入1ml预冷无水乙醇，10000 rpm离心5min，弃上清；吸掉残余液体，将离心管放于通风橱吹干，加入适量（100μl）ddH2O溶解，置于20℃环境中保存备用。
1.2.2 引物设计与及PCR扩增
上游随机引物如下：
AD1 5TGWGNAGWANCASAGA3‘
AD2 5AGWGNAGWANCAWAGG3
AD3 5CAWCGICNGAIASGAA3‘
AD4 5NTCGASTWTSGWGTT3
AD5 5GTCGASWGANAWGAA3‘
AD6 5WGTGNAGWANCANAGA3。
下游引物设计原则：引物的长度为22~26 nt，GC含量45~55％，Tm值60~70℃。其他要求和普通PCR反应用引物相同。根据实验得到的相关序列（自主知识产权未登录），用Primer 5.0软件设计引物，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成的下游序列为：
GSP1 5GTGCCTTTAGGTTGTGGATTGG3
GSP2 5TTGGTTGGCTAGTGAGTCCTCT3
GSP3 5CCTGAGAAGTTGAAGGGTTTGG3
以茶树花粉基因组DNA为模板，以AD和GSP1为引物进行PCR扩增反应，反应体系为：模板DNA 1μL，dNTP Mixture（2.5mm each）8μL，10×LA PCR Buffer II（Mg2+ plus）5μL，TaKaRa LA Taq（5 U/μl）0.5μL，AD Primer（100pmol/μl）1μL，GSP1/GSP2/GSP3（10pmol/μl）1μL，ddH2O 33.5μL，总体积50μL。反应程序为：94℃变性1 min，再98℃ 1 min；紧接着5个循环为94℃ 30s， 68℃ 1 min，72℃ 2 min；接着94℃ 30s，25℃ 3 min，72℃ 2 min；然后按照（94℃ 30s，68℃ 1 min，72℃ 2 min）—（94℃ 30s，68℃ 1 min，72℃ 2 min）—（94℃ 30s，44℃ 1 min，72℃ 2 min）方向进行15个循环；最后72℃延伸10min。反应完成后，将上述PCR反应液稀释50倍作为第二轮PCR扩增模板。第二轮PCR反应：以AD和GSP2引物进行PCR扩增，反应程序为：按照（94℃ 30s，68℃ 1 min，72℃ 2 min）—（94℃ 30s，68℃ 1 min，72℃ 2 min）—（94℃ 30s，44℃ 1 min，72℃ 2 min）方向进行15个循环；最后72℃延伸10min。反应完成后，将上述PCR反应液稀释50倍作为第三轮PCR扩增模板。第三轮PCR反应：以AD和GSP3引物进行PCR扩增，反应程序为：按照（94℃ 30s，68℃ 1 min，72℃ 2 min）—（94℃ 30s，68℃ 1 min，72℃ 2 min）—（94℃ 30s，44℃ 1 min，72℃ 2 min）方向进行15个循环；最后72℃延伸10min。电泳、照相并切下目的条带回收，于20℃下保存备用。
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