脱落酸蔗糖和生长素对葡萄果实着色和成熟的影响
摘要：有研究表明乙烯在跃变型果实的成熟过程中扮演关键角色，但非跃变型果实的成熟机制还不明确。在本研究中，研究者以生长8年的“藤稔”葡萄为试验材料，在葡萄花后两周开始用一定浓度的蔗糖溶液、脱落酸溶液、生长素溶液和水（对照）处理葡萄果穗，通过对发育成熟的葡萄果实进行RNA的提取和荧光定量PCR分析，结果发现脱落酸和蔗糖可以促进果实成熟进程，而生长素在果实成熟过程中起负调控作用。脱落酸和蔗糖诱导果实成熟相关基因的表达，如影响果实软化的基因 PE，PG，PL，CELL，果实着色基因DFR，CHI，F3H，GST，CHS，UFGT，和芳香基因Ecar， QR，EGS等，而生长素抑制这些基因的表达。这表明蔗糖、脱落酸和生长素协同调控了葡萄果实的发育成熟进程。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1材料 2
1.1.1植物材料2
1.1.2所用引物2
1.1.3生化试剂3
1.2方法 3
1.2.1 RNA的提取与纯化3
1.2.2 cDNA合成3
1.2.3荧光定量RTPCR3
1.2.4葡萄切片显微观察3
1.2.5着色率统计3
2结果与分析4
2.1葡萄组织观察4
2.1.1葡萄横剖面观察4
2.1.2葡萄切片显微观察4
2.2葡萄着色率变化5
2.3不同处理下果实成熟相关基因的表达量分析6
2.3.1与着色相关的基因表达量分析6
2.3.2与软化相关的基因表达量分析6
2.3.3与果实香气形成相关的基因表达量分析7
3讨论8
3.1蔗糖、ABA和生长素对果实成熟的影响8
3.2蔗糖和ABA之间可能存在协作8
致谢8
参考文献8
脱落酸、蔗糖和生长素对葡萄果实着色和成熟的影响
引言
果实发育和成熟是复杂的过程。这个过程包含了一系列生理变化，如果实变软
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥3^5`1^9`1^6^0`7^2$
，果皮着色和香气形成[12]。植物激素在调节这些生理变化过程中起重要作用[3]。有研究表明ABA作为一种重要的植物激素，可能在呼吸跃变型果实和非呼吸跃变型果实的成熟过程中都有参与。在呼吸跃变型果实如番茄中，ABA可能触发了乙烯的大量合成从而促进番茄果实成熟[45]。在非呼吸跃变型果实如甜樱桃上也发现了外源ABA处理可提高果实的成熟度和花青苷含量，加速果实软化，这说明ABA与果实成熟密切相关[6]。
葡萄着色是由于果皮中花青素的积累，ABA的一个重要作用是它对花青素合成的促进，为了探究ABA究竟是花青素合成中独一无二的启动子或者仅是触发花青素合成调控网络中的一个参与者，Gagné（2011）以不能自然合成花青苷的Cabernet Sauvignon葡萄品种为材料进行了研究[7]，发现在葡萄切片悬浮培养中，使用含有104 M ABA的培养基进行培养可以使葡萄变红，并从变红的葡萄中分离出了花青素，即ABA处理可以诱导花青素的合成。在分子层面上的实验进一步揭示了ABA处理可上调花青素合成上游基因表达 [89]。Ban等（2003）的研究发现，花青素的逐渐积累主要由UFGT和VvMYB A1这两个基因的表达导致，前者是花青素生物合成类黄酮途径的调控基因，后者是合成途径中转录调节因子的编码基因。除此之外，一些编码合成上游途径中的酶的基因的表达也起到作用，如PAL、CHI和CHS等[10]。Jeong等人（2004）发现ABA增加了VvMYBA1和调节花青素合成的一些酶的基因的表达[11]。Gagné等人（2011）在Cabernet Sauvignon葡萄上的实验发现，外源ABA处理诱导了一些花青素合成上游调控基因的上调表达，如VvPAL，VvC4H，VvCHI1，VvCHI2等，他的实验也进一步验证了ABA对VvMYBA1基因的正向调控作用[7]。
作为最早被发现的植物激素，生长素的作用主要涉及植物胚胎和果实的发育，但目前对生长素在调控葡萄成熟过程中的作用还知之甚少。对于外源生长素影响葡萄成熟的研究，大量实验表明在转色期前用外源生长素及其类似物处理葡萄，会推迟成熟或延迟某些成熟过程，如糖和花青素的积累、果实酸度和叶绿素含量水平的下降等。在对生长素类似物BTOA对推迟浆果成熟的研究上收获颇丰。Davies等（1997）在转色期前2周和转色期初两次用BTOA溶液浸蘸果穗，发现果实软化和糖分积累的过程被推迟了约两周[12]。花青素的积累也大幅下降，与花青素合成有关的基因的表达也受到抑制，如CHS和UFGT等。在对生长素类似物NAA的研究上，研究者们发现在转色期用NAA处理果穗，可以减少花青素积累。NAA还被发现可以推迟果皮中ABA含量的上升[13]。在研究生长素响应相关的基因后发现，生长素诱导的基因或响应生长素的基因在空间或时间上的表达上并无特定规律[14]。总之，外源生长素对成熟的抑制作用已经相对明确，但内源生长素在果实成熟中的作用还有待解释，对生长素合成或葡萄内信号网络系统的进一步了解或许会对明确这一点有所帮助。
除了激素信号转导之外，糖的信号转导在植物生长中也扮演了重要角色[1516]。有研究表明，蔗糖在高等植物中不仅是光合同化物与能量的贮藏和运输形式，也可以作为调控基因表达和植物生长发育的信号分子[17]。Cakir（2003）发现在葡萄中与成熟有关的ASR基因MSA在蔗糖和ABA同时存在下被强烈诱导[18]。他悬浮培养葡萄细胞，发现蔗糖可以诱导MSA基因表达，单独使用ABA处理不能诱导MSA表达，而在蔗糖存在时，用ABA处理可以诱导MSA更大量地表达。这表明MSA基因可能是蔗糖和ABA链接信号转导系统中的一环。Pirie和Mullins等（1976）通过用蔗糖和ABA分别处理离体葡萄的果梗[19]，发现二者均可以增加果皮中的花青素含量，据此他们推测蔗糖和ABA在共同作用时可能有协同关系。
在本研究中，我们发现ABA和蔗糖可以促进葡萄果实成熟，而生长素抑制果实成熟，在分子层面上对成熟相关基因相对表达量的分析也验证了这一点。
1 材料与方法
1．1 材料
实验所需材料包括植物材料、引物、生化试剂及相关仪器等。
1．1．1 植物材料 本试验以江苏省农科院种植的生长8年的“藤稔”葡萄为实验材料，在花后2周时向果穗喷施16 mM的蔗糖溶液、100 μM ABA、100 μM IAA和水（对照）。8周后取样，样品采集后，液氮速冻，于70℃下保存。
用于显微观察的葡萄材料从未处理的葡萄果穗上采集，在花后214周每两周采集一次。
1．1．2 所用引物 荧光定量PCR所用引物根据所研究的基因序列，用Primer 5 软件进行设计（http:// www.premierbiosoft.com/），如表1所示。
表1 引物序列
Table1 Primers sequence
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1材料 2
1.1.1植物材料2
1.1.2所用引物2
1.1.3生化试剂3
1.2方法 3
1.2.1 RNA的提取与纯化3
1.2.2 cDNA合成3
1.2.3荧光定量RTPCR3
1.2.4葡萄切片显微观察3
1.2.5着色率统计3
2结果与分析4
2.1葡萄组织观察4
2.1.1葡萄横剖面观察4
2.1.2葡萄切片显微观察4
2.2葡萄着色率变化5
2.3不同处理下果实成熟相关基因的表达量分析6
2.3.1与着色相关的基因表达量分析6
2.3.2与软化相关的基因表达量分析6
2.3.3与果实香气形成相关的基因表达量分析7
3讨论8
3.1蔗糖、ABA和生长素对果实成熟的影响8
3.2蔗糖和ABA之间可能存在协作8
致谢8
参考文献8
脱落酸、蔗糖和生长素对葡萄果实着色和成熟的影响
引言
果实发育和成熟是复杂的过程。这个过程包含了一系列生理变化，如果实变软
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥3^5`1^9`1^6^0`7^2$
，果皮着色和香气形成[12]。植物激素在调节这些生理变化过程中起重要作用[3]。有研究表明ABA作为一种重要的植物激素，可能在呼吸跃变型果实和非呼吸跃变型果实的成熟过程中都有参与。在呼吸跃变型果实如番茄中，ABA可能触发了乙烯的大量合成从而促进番茄果实成熟[45]。在非呼吸跃变型果实如甜樱桃上也发现了外源ABA处理可提高果实的成熟度和花青苷含量，加速果实软化，这说明ABA与果实成熟密切相关[6]。
葡萄着色是由于果皮中花青素的积累，ABA的一个重要作用是它对花青素合成的促进，为了探究ABA究竟是花青素合成中独一无二的启动子或者仅是触发花青素合成调控网络中的一个参与者，Gagné（2011）以不能自然合成花青苷的Cabernet Sauvignon葡萄品种为材料进行了研究[7]，发现在葡萄切片悬浮培养中，使用含有104 M ABA的培养基进行培养可以使葡萄变红，并从变红的葡萄中分离出了花青素，即ABA处理可以诱导花青素的合成。在分子层面上的实验进一步揭示了ABA处理可上调花青素合成上游基因表达 [89]。Ban等（2003）的研究发现，花青素的逐渐积累主要由UFGT和VvMYB A1这两个基因的表达导致，前者是花青素生物合成类黄酮途径的调控基因，后者是合成途径中转录调节因子的编码基因。除此之外，一些编码合成上游途径中的酶的基因的表达也起到作用，如PAL、CHI和CHS等[10]。Jeong等人（2004）发现ABA增加了VvMYBA1和调节花青素合成的一些酶的基因的表达[11]。Gagné等人（2011）在Cabernet Sauvignon葡萄上的实验发现，外源ABA处理诱导了一些花青素合成上游调控基因的上调表达，如VvPAL，VvC4H，VvCHI1，VvCHI2等，他的实验也进一步验证了ABA对VvMYBA1基因的正向调控作用[7]。
作为最早被发现的植物激素，生长素的作用主要涉及植物胚胎和果实的发育，但目前对生长素在调控葡萄成熟过程中的作用还知之甚少。对于外源生长素影响葡萄成熟的研究，大量实验表明在转色期前用外源生长素及其类似物处理葡萄，会推迟成熟或延迟某些成熟过程，如糖和花青素的积累、果实酸度和叶绿素含量水平的下降等。在对生长素类似物BTOA对推迟浆果成熟的研究上收获颇丰。Davies等（1997）在转色期前2周和转色期初两次用BTOA溶液浸蘸果穗，发现果实软化和糖分积累的过程被推迟了约两周[12]。花青素的积累也大幅下降，与花青素合成有关的基因的表达也受到抑制，如CHS和UFGT等。在对生长素类似物NAA的研究上，研究者们发现在转色期用NAA处理果穗，可以减少花青素积累。NAA还被发现可以推迟果皮中ABA含量的上升[13]。在研究生长素响应相关的基因后发现，生长素诱导的基因或响应生长素的基因在空间或时间上的表达上并无特定规律[14]。总之，外源生长素对成熟的抑制作用已经相对明确，但内源生长素在果实成熟中的作用还有待解释，对生长素合成或葡萄内信号网络系统的进一步了解或许会对明确这一点有所帮助。
除了激素信号转导之外，糖的信号转导在植物生长中也扮演了重要角色[1516]。有研究表明，蔗糖在高等植物中不仅是光合同化物与能量的贮藏和运输形式，也可以作为调控基因表达和植物生长发育的信号分子[17]。Cakir（2003）发现在葡萄中与成熟有关的ASR基因MSA在蔗糖和ABA同时存在下被强烈诱导[18]。他悬浮培养葡萄细胞，发现蔗糖可以诱导MSA基因表达，单独使用ABA处理不能诱导MSA表达，而在蔗糖存在时，用ABA处理可以诱导MSA更大量地表达。这表明MSA基因可能是蔗糖和ABA链接信号转导系统中的一环。Pirie和Mullins等（1976）通过用蔗糖和ABA分别处理离体葡萄的果梗[19]，发现二者均可以增加果皮中的花青素含量，据此他们推测蔗糖和ABA在共同作用时可能有协同关系。
在本研究中，我们发现ABA和蔗糖可以促进葡萄果实成熟，而生长素抑制果实成熟，在分子层面上对成熟相关基因相对表达量的分析也验证了这一点。
1 材料与方法
1．1 材料
实验所需材料包括植物材料、引物、生化试剂及相关仪器等。
1．1．1 植物材料 本试验以江苏省农科院种植的生长8年的“藤稔”葡萄为实验材料，在花后2周时向果穗喷施16 mM的蔗糖溶液、100 μM ABA、100 μM IAA和水（对照）。8周后取样，样品采集后，液氮速冻，于70℃下保存。
用于显微观察的葡萄材料从未处理的葡萄果穗上采集，在花后214周每两周采集一次。
1．1．2 所用引物 荧光定量PCR所用引物根据所研究的基因序列，用Primer 5 软件进行设计（http:// www.premierbiosoft.com/），如表1所示。
表1 引物序列
Table1 Primers sequence
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