梨aca基因家族分析(附件)
摘要：通过基因结构分析，氨基酸序列分析，结构域分析确定了梨中拥有24个ACA基因。这些ACA基因分别具有钙调素自抑制结构域，钙离子转运结构域，跨膜结构域，与拟南芥中ACA具有相同结构域。最后通过半定量分析，鉴定出了只在梨花粉中特异表达的基因PbrACA12。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法 2
1.1材料 2
1.2方法 2
1.2.1生物信息学分析软件及网站 2
1.2.2梨不同组织总RNA提取及反转录 3
1.2.3梨ACA家族基因的组织特异性半定量检测 3
2结果与分析 4
2.1梨ACA基因家族鉴定 4
2.2梨ACA基因家族序列特征与进化分析 5
2.3梨ACA基因家族编码的氨基酸结构分析 6
2.4梨ACA基因家族表达模式分析 7
3结论 8
致谢8
参考文献9
梨ACA基因家族分析
引言
自交不亲和性是显花植物中普遍存在的防止近亲繁殖和促进远缘杂交的一种遗传机制[12]。它作为防止近亲繁殖和物种退化的异花授粉机制，为物种的生存、发展及其相对独立性提供了有力的保障[3]。梨是一种配子体自交不亲和的世界性果树[4]，生产栽培中必须配置授粉品种或通过人工授粉等措施来保证高产稳产。配置授粉品种时，首先要考虑品种间的亲和性，而品种间的亲和性取决于两个品种的S基因型，S基因型相同则为杂交不亲和，否则为杂交亲和。因此，梨自交不亲和性以及自交不亲和基因的研究可以为梨丰产栽培和遗传改良提供重要的科学依据[5]。
有关植物自交不亲和性反应过程中雌蕊和花粉间信号分子的识别与相互作用、细胞间及细胞内信息传递、信号转导机制的研究仅在配子体型自交不亲和的婴粟科植物和抱子体型自交不亲和的十字花科植物中报道较多[6]。近几年，对梨自交不亲和性反应过程中的信号转导机制的初步研究己经建立起了适合于梨自交不亲和性反应的信号分子生物学的研究方法；发现了Ca2+ 参与了梨自交不亲和性反应过程中花粉和柱头识别的
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
初始反应和梨花粉的萌发以及花粉管生长过程[79]。证实了雌蕊胞外基质组分SRNase等介导的梨雌蕊识别自我与非我花粉或花粉管的反应与花粉或花粉管质膜上异三聚体G蛋白的活性和胞内Ca2+这两类信号分子的活动有关，并且G蛋白的调控作用是通过花粉胞内游离Ca2+浓度的动态变化实现的[1011]。
近几十年，基于生物化学和分子生物学水平关于高等植物钙离子泵的研究已经表明其在结构功能关系和生理等方面与动物钙离子转运体具有许多相似性。动物、真菌及高等植物中Ca2+ATPases的功能被认为主要是正向调节低的胞质钙离子浓度[12]。但植物和动物间存在不同。例如，动物的钙调蛋白存在于质膜调节Ca2+ATPases[13]，植物中也表现在内膜系统[14]。此外，部分植物在N端有一个独特结构包含CaM 调节自抑区[15]。先前报道，只在P型ATPases鉴定得到C端的自抑区域，例如动物的CaM刺激钙离子泵和植物的质膜H+ ATPases[16]。
钙激活通道受钙离子激活，同时又能在外界刺激影响后恢复胞质游离钙离子浓度[17]，因此被普遍认为是植物响应不同刺激时调控钙离子变化的关键蛋白[18]。植物中的钙离子通道属于动物中2类P型离子泵亚家族，均能通过磷酸化而改变构型，调控钙离子的流动[19]。高等植物基因组中分别编码有两类P型离子泵，一种类似于动物细胞中内质网定位P型离子泵（ECA，ERtype Ca2+ATPase），另一种类似于动物细胞中质膜定位型离子泵（ACA，autoinhibited Ca2+ATPase）。目前拟南芥中有4种ECA以及10种ACA基因[20]。
普遍认为拟南芥叶绿体内膜上的ACA1是第一个被克隆得到的植物IIB型Ca2+ATPases[21]。ACA1缺少一个明显存在于哺乳动物中的C端CaM结合区域。相反，ACA1展示了一个长的N端延伸包括7080个氨基酸区域，与质膜磷酸盐转运分子的转运氨基酸相似。随后，拟南芥ACA2被克隆[15]，有证据表明ACA2能够编码CaM调节钙离子泵。拟南芥ACA2的酵母功能互补实验表明具有钙离子/CaM刺激Ca2+ATPases活性。进一步研究，通过蛋白融合的CaM覆盖实验将CaM结合区域定位在N端的前36个残基。通过N端删除酶的基因和生化分析确定N端区域的自抑功能。CaM激活ACA4的Ca2+ATPases活性[22]。实验证明CaM结合在ACA4的N端，利用肌酸激酶CaM荧光实验确认了ACA4的N端和CaM互作。ACA4定位于内膜，是这个亚家族中第一个通过生理功能确定的成员，有证据表明ACA4可能与植物抗盐胁迫相关。另有三个IIB型Ca2+ATPases，ACA8、ACA9、ACA10比ACA2、ACA4更长。前两个蛋白的基因结构被重建基于已知的IIB型Ca2+ATPases，但是终止密码子没有被确定，蛋白略长于已有的1082个氨基酸[22]。
目前对于梨中ACA基因的分类还不清楚，同时ACA基因在梨花粉自交不亲和过程中如何影响钙离子更不明确，而本研究的主要目的是对起进行分类，确定其在花粉自交不亲和过程中的表达模式，为后续深入研究该基因提供基础。
1 材料与方法
1.1 材料
梨的根、茎、叶、花粉、花柱、果实材料，均由大学梨工程技术研究中心提供。植物RNA提取为FOREGENE多糖多酚植物总RNA提取试剂盒，反转录试剂盒购自TaKaRa公司，引物合成自上海英骏公司。
1.2 方法
1.2.1 生物信息学分析软件及网站
序列获取：利用Tair网站下载已报道的拟南芥ACA家族的蛋白及基因序列，在梨中心数据库通过Blastp比对并下载所需ACA基因家族蛋白及基因序列。
构建进化树：使用MEGA6.0软件，输入蛋白或CDS序列采用邻接法（ NeighborJoining， NJ）生成 基因的系统进化树，校验参数 Bootstrap 重复1 000 次，可从进化树中分析同源关系及可信度。
保守结构域分析：利用Pfam或Interpro均可分析基因的domain
（Pfam：http://pfam.xfam.org/；Interpro：http://www.ebi.ac.uk/interpro/）。
Motif分析：利用MEME分析ACA家族成员所有的motif。（http：//memesuite.org/tools/meme）
基因结构分析：使用Gene Structure Display Server 2.0绘制外显子内含子结构图(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法 2
1.1材料 2
1.2方法 2
1.2.1生物信息学分析软件及网站 2
1.2.2梨不同组织总RNA提取及反转录 3
1.2.3梨ACA家族基因的组织特异性半定量检测 3
2结果与分析 4
2.1梨ACA基因家族鉴定 4
2.2梨ACA基因家族序列特征与进化分析 5
2.3梨ACA基因家族编码的氨基酸结构分析 6
2.4梨ACA基因家族表达模式分析 7
3结论 8
致谢8
参考文献9
梨ACA基因家族分析
引言
自交不亲和性是显花植物中普遍存在的防止近亲繁殖和促进远缘杂交的一种遗传机制[12]。它作为防止近亲繁殖和物种退化的异花授粉机制，为物种的生存、发展及其相对独立性提供了有力的保障[3]。梨是一种配子体自交不亲和的世界性果树[4]，生产栽培中必须配置授粉品种或通过人工授粉等措施来保证高产稳产。配置授粉品种时，首先要考虑品种间的亲和性，而品种间的亲和性取决于两个品种的S基因型，S基因型相同则为杂交不亲和，否则为杂交亲和。因此，梨自交不亲和性以及自交不亲和基因的研究可以为梨丰产栽培和遗传改良提供重要的科学依据[5]。
有关植物自交不亲和性反应过程中雌蕊和花粉间信号分子的识别与相互作用、细胞间及细胞内信息传递、信号转导机制的研究仅在配子体型自交不亲和的婴粟科植物和抱子体型自交不亲和的十字花科植物中报道较多[6]。近几年，对梨自交不亲和性反应过程中的信号转导机制的初步研究己经建立起了适合于梨自交不亲和性反应的信号分子生物学的研究方法；发现了Ca2+ 参与了梨自交不亲和性反应过程中花粉和柱头识别的
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
初始反应和梨花粉的萌发以及花粉管生长过程[79]。证实了雌蕊胞外基质组分SRNase等介导的梨雌蕊识别自我与非我花粉或花粉管的反应与花粉或花粉管质膜上异三聚体G蛋白的活性和胞内Ca2+这两类信号分子的活动有关，并且G蛋白的调控作用是通过花粉胞内游离Ca2+浓度的动态变化实现的[1011]。
近几十年，基于生物化学和分子生物学水平关于高等植物钙离子泵的研究已经表明其在结构功能关系和生理等方面与动物钙离子转运体具有许多相似性。动物、真菌及高等植物中Ca2+ATPases的功能被认为主要是正向调节低的胞质钙离子浓度[12]。但植物和动物间存在不同。例如，动物的钙调蛋白存在于质膜调节Ca2+ATPases[13]，植物中也表现在内膜系统[14]。此外，部分植物在N端有一个独特结构包含CaM 调节自抑区[15]。先前报道，只在P型ATPases鉴定得到C端的自抑区域，例如动物的CaM刺激钙离子泵和植物的质膜H+ ATPases[16]。
钙激活通道受钙离子激活，同时又能在外界刺激影响后恢复胞质游离钙离子浓度[17]，因此被普遍认为是植物响应不同刺激时调控钙离子变化的关键蛋白[18]。植物中的钙离子通道属于动物中2类P型离子泵亚家族，均能通过磷酸化而改变构型，调控钙离子的流动[19]。高等植物基因组中分别编码有两类P型离子泵，一种类似于动物细胞中内质网定位P型离子泵（ECA，ERtype Ca2+ATPase），另一种类似于动物细胞中质膜定位型离子泵（ACA，autoinhibited Ca2+ATPase）。目前拟南芥中有4种ECA以及10种ACA基因[20]。
普遍认为拟南芥叶绿体内膜上的ACA1是第一个被克隆得到的植物IIB型Ca2+ATPases[21]。ACA1缺少一个明显存在于哺乳动物中的C端CaM结合区域。相反，ACA1展示了一个长的N端延伸包括7080个氨基酸区域，与质膜磷酸盐转运分子的转运氨基酸相似。随后，拟南芥ACA2被克隆[15]，有证据表明ACA2能够编码CaM调节钙离子泵。拟南芥ACA2的酵母功能互补实验表明具有钙离子/CaM刺激Ca2+ATPases活性。进一步研究，通过蛋白融合的CaM覆盖实验将CaM结合区域定位在N端的前36个残基。通过N端删除酶的基因和生化分析确定N端区域的自抑功能。CaM激活ACA4的Ca2+ATPases活性[22]。实验证明CaM结合在ACA4的N端，利用肌酸激酶CaM荧光实验确认了ACA4的N端和CaM互作。ACA4定位于内膜，是这个亚家族中第一个通过生理功能确定的成员，有证据表明ACA4可能与植物抗盐胁迫相关。另有三个IIB型Ca2+ATPases，ACA8、ACA9、ACA10比ACA2、ACA4更长。前两个蛋白的基因结构被重建基于已知的IIB型Ca2+ATPases，但是终止密码子没有被确定，蛋白略长于已有的1082个氨基酸[22]。
目前对于梨中ACA基因的分类还不清楚，同时ACA基因在梨花粉自交不亲和过程中如何影响钙离子更不明确，而本研究的主要目的是对起进行分类，确定其在花粉自交不亲和过程中的表达模式，为后续深入研究该基因提供基础。
1 材料与方法
1.1 材料
梨的根、茎、叶、花粉、花柱、果实材料，均由大学梨工程技术研究中心提供。植物RNA提取为FOREGENE多糖多酚植物总RNA提取试剂盒，反转录试剂盒购自TaKaRa公司，引物合成自上海英骏公司。
1.2 方法
1.2.1 生物信息学分析软件及网站
序列获取：利用Tair网站下载已报道的拟南芥ACA家族的蛋白及基因序列，在梨中心数据库通过Blastp比对并下载所需ACA基因家族蛋白及基因序列。
构建进化树：使用MEGA6.0软件，输入蛋白或CDS序列采用邻接法（ NeighborJoining， NJ）生成 基因的系统进化树，校验参数 Bootstrap 重复1 000 次，可从进化树中分析同源关系及可信度。
保守结构域分析：利用Pfam或Interpro均可分析基因的domain
（Pfam：http://pfam.xfam.org/；Interpro：http://www.ebi.ac.uk/interpro/）。
Motif分析：利用MEME分析ACA家族成员所有的motif。（http：//memesuite.org/tools/meme）
基因结构分析：使用Gene Structure Display Server 2.0绘制外显子内含子结构图(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)。
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