溧阳白芹’黑暗处理及其光照恢复过程中叶绿素变化及相关基因表达分析
摘要：[目的]研究黑暗处理及其恢复光照处理条件下，‘溧阳白芹’叶绿素含量的变化情况，以及参与调控叶绿素代谢途径的相关基因响应情况，以期为‘溧阳白芹’软化栽培提供生理及分子理论参考。[方法]以‘溧阳白芹’为研究材料，进行不同时期黑暗处理（0 d、4 d、8 d、12 d、16 d、20 d、25 d），对16 d和20 d黑暗处理的植株进行2 d、4 d的恢复光照处理。分别取各阶段的叶片和叶柄作为试验材料，测定叶绿素的含量变化，并利用实时荧光定量PCR技术，研究参与调控叶绿素代谢途径的13个基因的表达情况。[结果]叶绿素含量测定结果表明，随着黑暗处理时间的增加，叶片以及叶柄中的叶绿素含量均降低，恢复处理后，新叶片以及叶柄中叶绿素的含量升高。实时荧光定量PCR结果显示，‘溧阳白芹’黑暗处理后，参与调控叶绿素循环的基因表达量降低，而参与调控叶绿素降解的脱镁叶绿酸氧化酶（Pheophorbide a oxygenase）、脱镁叶绿素酶（Pheophytinase）、叶绿素b还原酶NYC1（Chlorophyll(ide) b reductase NYC1）3个基因的表达量升高。恢复光照处理后，参与调控叶绿素循环的基因表达量均升高。[结论]黑暗处理后的‘溧阳白芹’叶片变黄，茎杆变白，叶绿素a、叶绿素b的含量均降低，参与调控叶绿素循环的基因表达量降低，而参与调控叶绿素降解的基因表达量升高。综合黑暗处理及恢复光照处理的植株生长情况、分子表达水平、叶绿素含量，认为‘溧阳白芹’黑暗处理最佳时常为16 d。在16 d黑暗处理过程中，植株长势较好，叶柄中叶绿素含量与黑暗处理8 d、12 d植株的叶绿素含量大致相同，基因表达量较低，恢复光照后，叶绿素含量升高慢，基因表达量升高较慢。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words4
引言4
1材料与方法4
1.1植物材料 4
1.2叶绿素测定方法 4
1.3 RNA 的提取及 cDNA 的合成5
1.4实时荧光定量PCR5
1.5数据处理6
2 结果与分析6
2.1黑暗处理及其恢复光照溧阳白芹形态变化6
2.2‘溧阳白芹’
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
黑暗处理及其恢复光照过程中叶绿素的变化7
2.3‘溧阳白芹’叶绿素通道基因暗处理表达变化8
2.4恢复处理后叶绿素通道基因表达量11
3讨论12
致谢13
参考文献14
表1荧光定量引物5
图1叶绿素降解及转化循环6
图2恢复处理后植株生长情况7
图3黑暗处理后叶绿素含量变化情况8
图4恢复光照后植株叶绿素含量8
图5叶绿素降解及转化循环9
图6参与调节叶绿素降解及转化循环的基因表达情况10
图 7恢复光照后参与调节叶绿素降解及转化循环的基因表达情况11
‘溧阳白芹’黑暗处理及其光照恢复过程中叶绿素变化及相关基因表达分析
引言
‘溧阳白芹’（Liyang Oenanthe stolonifera）别名水英、楚葵，为伞形科水芹属(Oenanthe stolonifera D.C.)、水生宿根草本植物[1]。性喜冷凉，叶片黄绿色，叶柄为青绿色，是尖叶型水芹的优良品种[2]。暗处理后抽生鲜嫩叶柄，富含多种维生素和无机盐，其中以钙、磷、铁的含量较高[3]。具有清热解毒、消热利尿、抗炎降压等保健功能[4]，为我国江苏省溧阳市特有的一种蔬菜[5]。
叶绿素（chlorophyll)是一类与光合作用(photosynthesis)相关的重要的色素[6]。叶绿素为镁卟啉化合物[67]，由两部分组成：核心部分是一个卟啉环(Porphyrin ring)，其功能是吸收光；另一部分是较长的脂肪烃侧链，称为叶绿醇(phytol)[8]。在叶绿素酶（Chlorophyllase）、脱镁叶绿素酶(MgDechelatase)的作用下，叶绿素分别脱去了植基(Phytol)和镁离子(Mg2+)形成了具环状结构的脱镁叶绿素a (Pheophorbide a)[9]。在脱镁叶绿酸氧化酶(Pheophorbide a Oxygenase, PaO)作用下，卟啉环裂解形成红色的叶绿素降解产物(Red Chlorophyll catabolite，RCC)[10]。另外，研究表明，叶绿素a和叶绿素b之间也存在相互转换的关系[11]，叶绿素b首先在叶绿素b还原酶的作用下还原为7羟甲基叶绿a (7hydroxymethyl chlorophyll a, HMChl a) [1213], 7羟甲基叶绿a在7羟甲基叶绿素a还原酶(hydroxymethyl chlorophyll a reductase, HCAR)的催化下转化为叶绿素a[1415]。因而，叶绿素代谢的途径包括：叶绿素降解过程；叶绿素a与叶绿素b之间的相互转化过程，形成叶绿素循环系统。‘溧阳白芹’白化过程以及白化恢复光照后，叶绿素的变化及其分子表达响应情况尚未清楚，本试验从生理及分子角度，对‘溧阳白芹’进行研究。
本试验以‘溧阳白芹’为研究材料，对其进行不同时期的黑暗处理及其处理后恢复光照生长。以未处理的样品作对照，取不同黑暗处理时期以及处理后恢复光照的叶及叶柄进行叶绿素含量的测定，研究暗处理叶柄及其叶片叶绿素变化的规律。利用实时荧光定量PCR技术，对其叶及叶柄在黑暗条件及处理后恢复光照下，叶绿素合成代谢途径基因表达情况，以阐明‘溧阳白芹’叶绿素通道基因在不同处理条件下的表达情况。最终，通过从叶绿素含量变化及其代谢基因的响应，确定‘溧阳白芹’黑暗处理的最佳时长以及商品货架期，为‘溧阳白芹’产业化的贮藏、加工、销售提供理论依据与实践参考。
1 材料与方法
1．1 植物材料
供试水芹品种为‘溧阳白芹’，种植于大学作物遗传与种质创新国家重点实验室人工气候室中，光密度为33 umol*（m2s）1，光周期12 h/12 h（光照/黑暗），温度为25 ℃/18 ℃（光照/黑暗）。以扦插2个月的植株作为实验材料进行黑暗处理（处理时间为：0 d、4 d、8 d、12 d、16 d、20 d、25 d），并将黑暗处理16 d、20 d的植株分别光照恢复2 d、4 d。每次取样均取同一生长势的叶片和叶柄，恢复处理的植株以新长出的叶片及叶柄作为试验材料。黑暗的样品均以未经黑暗处理的植株作为对照，恢复处理的样品均以黑暗处理的相应天数的样品作为对照。各阶段的试验材料取下后用液氮速冻，转入80℃冰箱中保存。
1．2 叶绿素测定方法
用95％乙醇分别提取处理个阶段‘溧阳白芹’叶及叶柄中叶绿素，利用分光光度计分别测定叶绿素a和叶绿素b的含量，叶绿素测定使用的仪器为Alpha－1860型紫外分光光度计(谱元仪器有限公司，上海)，叶绿素a和叶绿素b的95％乙醇提取液在红光区的最大吸收峰分别为665 nm和649 nm[16]，因而根据以下公式计算总叶绿素含量：
Ca=13.95A6656.88A649；
Cb=24.96A6497.32A665；
CT=Ca+Cb；
叶绿素含量（mg/g）=C*V*N/1000m
式中，Ca、Cb分别为叶绿素a、b的浓度；A665、A649分别为叶绿素在665 nm、649 nm下的吸光度；CT为总叶绿素的浓素；C为色素含量（mg/L）；V为提取液体积（mL）；N为稀释倍数；m为样品质量（g）；1000表示1L=1000 mL。
1．3 RNA 的提取及 cDNA 的合成
采用 RNA simple Total RNA Kit总RNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司，北京）提取各阶段叶及叶柄中的总RNA，利用 Prime Script RT reagent Kit(宝生物工程有限公司公司，大连)将提取的总RNA反转录成cDNA。
1．4 实时荧光定量PCR
荧光定量PCR采用Bio Rad CFX96 Realtime System和Bio Rad CFX Manager完成。本试验中所用的14个基因来自于本实验室建立的水芹转录组数据，利用PEIMER5设计引物（表1）。用水芹actin基因（Phosphatase 2A）作为参考基因，与目标基因一起扩增。以水芹actin基因作为内参[1718]，相对定量使用参照基因的ΔCt法，表达差异用2－ΔΔCt表示。其中，ΔCT=CT目标基因－CTactin，ΔΔCT = ΔCT处理－ΔCT对照。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words4
引言4
1材料与方法4
1.1植物材料 4
1.2叶绿素测定方法 4
1.3 RNA 的提取及 cDNA 的合成5
1.4实时荧光定量PCR5
1.5数据处理6
2 结果与分析6
2.1黑暗处理及其恢复光照溧阳白芹形态变化6
2.2‘溧阳白芹’
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
黑暗处理及其恢复光照过程中叶绿素的变化7
2.3‘溧阳白芹’叶绿素通道基因暗处理表达变化8
2.4恢复处理后叶绿素通道基因表达量11
3讨论12
致谢13
参考文献14
表1荧光定量引物5
图1叶绿素降解及转化循环6
图2恢复处理后植株生长情况7
图3黑暗处理后叶绿素含量变化情况8
图4恢复光照后植株叶绿素含量8
图5叶绿素降解及转化循环9
图6参与调节叶绿素降解及转化循环的基因表达情况10
图 7恢复光照后参与调节叶绿素降解及转化循环的基因表达情况11
‘溧阳白芹’黑暗处理及其光照恢复过程中叶绿素变化及相关基因表达分析
引言
‘溧阳白芹’（Liyang Oenanthe stolonifera）别名水英、楚葵，为伞形科水芹属(Oenanthe stolonifera D.C.)、水生宿根草本植物[1]。性喜冷凉，叶片黄绿色，叶柄为青绿色，是尖叶型水芹的优良品种[2]。暗处理后抽生鲜嫩叶柄，富含多种维生素和无机盐，其中以钙、磷、铁的含量较高[3]。具有清热解毒、消热利尿、抗炎降压等保健功能[4]，为我国江苏省溧阳市特有的一种蔬菜[5]。
叶绿素（chlorophyll)是一类与光合作用(photosynthesis)相关的重要的色素[6]。叶绿素为镁卟啉化合物[67]，由两部分组成：核心部分是一个卟啉环(Porphyrin ring)，其功能是吸收光；另一部分是较长的脂肪烃侧链，称为叶绿醇(phytol)[8]。在叶绿素酶（Chlorophyllase）、脱镁叶绿素酶(MgDechelatase)的作用下，叶绿素分别脱去了植基(Phytol)和镁离子(Mg2+)形成了具环状结构的脱镁叶绿素a (Pheophorbide a)[9]。在脱镁叶绿酸氧化酶(Pheophorbide a Oxygenase, PaO)作用下，卟啉环裂解形成红色的叶绿素降解产物(Red Chlorophyll catabolite，RCC)[10]。另外，研究表明，叶绿素a和叶绿素b之间也存在相互转换的关系[11]，叶绿素b首先在叶绿素b还原酶的作用下还原为7羟甲基叶绿a (7hydroxymethyl chlorophyll a, HMChl a) [1213], 7羟甲基叶绿a在7羟甲基叶绿素a还原酶(hydroxymethyl chlorophyll a reductase, HCAR)的催化下转化为叶绿素a[1415]。因而，叶绿素代谢的途径包括：叶绿素降解过程；叶绿素a与叶绿素b之间的相互转化过程，形成叶绿素循环系统。‘溧阳白芹’白化过程以及白化恢复光照后，叶绿素的变化及其分子表达响应情况尚未清楚，本试验从生理及分子角度，对‘溧阳白芹’进行研究。
本试验以‘溧阳白芹’为研究材料，对其进行不同时期的黑暗处理及其处理后恢复光照生长。以未处理的样品作对照，取不同黑暗处理时期以及处理后恢复光照的叶及叶柄进行叶绿素含量的测定，研究暗处理叶柄及其叶片叶绿素变化的规律。利用实时荧光定量PCR技术，对其叶及叶柄在黑暗条件及处理后恢复光照下，叶绿素合成代谢途径基因表达情况，以阐明‘溧阳白芹’叶绿素通道基因在不同处理条件下的表达情况。最终，通过从叶绿素含量变化及其代谢基因的响应，确定‘溧阳白芹’黑暗处理的最佳时长以及商品货架期，为‘溧阳白芹’产业化的贮藏、加工、销售提供理论依据与实践参考。
1 材料与方法
1．1 植物材料
供试水芹品种为‘溧阳白芹’，种植于大学作物遗传与种质创新国家重点实验室人工气候室中，光密度为33 umol*（m2s）1，光周期12 h/12 h（光照/黑暗），温度为25 ℃/18 ℃（光照/黑暗）。以扦插2个月的植株作为实验材料进行黑暗处理（处理时间为：0 d、4 d、8 d、12 d、16 d、20 d、25 d），并将黑暗处理16 d、20 d的植株分别光照恢复2 d、4 d。每次取样均取同一生长势的叶片和叶柄，恢复处理的植株以新长出的叶片及叶柄作为试验材料。黑暗的样品均以未经黑暗处理的植株作为对照，恢复处理的样品均以黑暗处理的相应天数的样品作为对照。各阶段的试验材料取下后用液氮速冻，转入80℃冰箱中保存。
1．2 叶绿素测定方法
用95％乙醇分别提取处理个阶段‘溧阳白芹’叶及叶柄中叶绿素，利用分光光度计分别测定叶绿素a和叶绿素b的含量，叶绿素测定使用的仪器为Alpha－1860型紫外分光光度计(谱元仪器有限公司，上海)，叶绿素a和叶绿素b的95％乙醇提取液在红光区的最大吸收峰分别为665 nm和649 nm[16]，因而根据以下公式计算总叶绿素含量：
Ca=13.95A6656.88A649；
Cb=24.96A6497.32A665；
CT=Ca+Cb；
叶绿素含量（mg/g）=C*V*N/1000m
式中，Ca、Cb分别为叶绿素a、b的浓度；A665、A649分别为叶绿素在665 nm、649 nm下的吸光度；CT为总叶绿素的浓素；C为色素含量（mg/L）；V为提取液体积（mL）；N为稀释倍数；m为样品质量（g）；1000表示1L=1000 mL。
1．3 RNA 的提取及 cDNA 的合成
采用 RNA simple Total RNA Kit总RNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司，北京）提取各阶段叶及叶柄中的总RNA，利用 Prime Script RT reagent Kit(宝生物工程有限公司公司，大连)将提取的总RNA反转录成cDNA。
1．4 实时荧光定量PCR
荧光定量PCR采用Bio Rad CFX96 Realtime System和Bio Rad CFX Manager完成。本试验中所用的14个基因来自于本实验室建立的水芹转录组数据，利用PEIMER5设计引物（表1）。用水芹actin基因（Phosphatase 2A）作为参考基因，与目标基因一起扩增。以水芹actin基因作为内参[1718]，相对定量使用参照基因的ΔCt法，表达差异用2－ΔΔCt表示。其中，ΔCT=CT目标基因－CTactin，ΔΔCT = ΔCT处理－ΔCT对照。
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