胡萝卜erf转录因子基因的克隆与表达特性分析
摘要：ERF转录因子是AP2家族的成员之一，参与植物对逆境的应答，在植物生长、发育、抗病、抗胁迫以及次生代谢等方面起着重要作用。本研究以胡萝卜品种‘黑田五寸’为试验材料，通过PCR和RT-PCR方法分别从胡萝卜的cDNA中克隆得到ERF-B3-1基因。分析显示，来源于胡萝卜中的ERF-B3-1基因全长为1026bp， ERF-B3-1中含有内含子，该基因编码226个氨基酸，含有相对保守的AP2结合域，具有植物ERF类转录因子特征。从氨基酸组成成分、理化性质、亲水性/疏水性、三级结构上分析显示，胡萝卜中的转录因子具有亲水性蛋白。胡萝卜中的这个转录因子与拟南芥AtERF具有相似的三级结构。实时定量PCR分析表明，胡萝卜中ERF基因在胡萝卜根中表达量最高，高温、低温、NaCl处理均能诱导该基因表达，不同品种间存在差异。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
1材料与方法4
1.1试验材料、菌株与质粒4
1.2DNA、RNA的提取及cDNA的合成4
1.3胡萝卜ERFB31基因的克隆4
1.4序列分析 4
1.5实时定量PCR反应 5
2结果分析 5
2.1 胡萝卜ERFB31基因的克隆5
2.2 胡萝卜ERFB31转录因子的序列比对和进化树分析6
2.3 胡萝卜ERFB31转录因子推导氨基酸组成及理化性质7
2.4 胡萝卜ERFB31转录因子推导氨基酸亲水性/疏水性分析8
2.5 胡萝卜ERFB31蛋白的三级结构预测与分析9
2.6胡萝卜ERFB31基因在胡萝卜不同组织表达情况9
2.7 胡萝卜ERFB31基因在不同逆境处理下表达情况10
3 结论 10
致谢11
参考文献11
胡萝卜ERF转录因子基因的克隆与表达特性分析
引言
当植物受到环境中生物和非生物逆境胁迫时，一些基因能做出快速应答来避免植物受到逆境的伤害，转录因子（Transcription factors）是其中重要的一类调节因子。转录因子又
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥3^5`1^9`1^6^0`7^2$
称反式作用因子，是和专一性DNA序列结合并能激活或抑制其它基因转录的蛋白质分子[1]。AP2/ERF家族是植物中一类重要的转录因子，主要分为四个亚族，分别为DREB、ERF、AP2和RAV。ERF亚家族是植物转录因子中的一个大家族，在植物的生长、发育、抗病、抗胁迫以及次生代谢等方面都起着很重要的作用。
胡萝卜是伞形科胡萝卜属二年生草本植物。以肉质根作蔬菜食用。原产亚洲西南部，阿富汗为最早演化中心，栽培历史在2000年以上。胡萝卜一生中受到多种生物和非生物胁迫的伤害，其中非生物胁迫中的高温、低温、干旱、高盐等都严重影响了胡萝卜的产量和品质。为了避免逆境胁迫对胡萝卜的伤害，人们在胡萝卜生产栽培管理的措施与技术上做了大量的研究和推广，取得了很多的成效，但是对胡萝卜抗逆分子机理仍缺乏较为深刻的认识。
目前，胡萝卜的分子研究正处于起步和发展阶段，为了进一步研究胡萝卜逆境调控中转录因子的作用，本研究选取胡萝卜‘黑田五寸’，对其AP2/ERF家族转录因子ERFB31基因进行了克隆，并对其进行了较为详尽的序列、进化树和三级结构等方面的分析。利用荧光定量PCR进行了ERFB31基因组织特异表达研究。通过高温（38℃）、低温（4℃）、干旱胁迫（PEG）、盐胁迫（NaCL）处理，测定了‘黑田五寸’中ERFB31基因非生物胁迫诱导表达情况，以期为进一步深入研究胡萝卜AP2/ERF家族转录因子在胡萝卜生长发育和逆境调控中的作用提供借鉴。
1 材料与方法
1.1试验材料、菌株与质粒
供试材料为胡萝卜‘黑田五寸’的成熟植株，从一株植株上分别取根、茎、叶、等组织材料，进行各部位RNA的提取及cDNA的合成。并对未受病、虫侵害的植株进行胁迫处理：4℃低温、38℃高温、干旱处理、200mmol/L NaCl处理分别1、2、4、8、24h，提取叶片RNA进行反转录成cDNA，用于实时定量PCR。另外以黑田五寸叶片cDNA为模板进行ERF1基因的克隆。胡萝卜材料种植于大学园艺学院蔬菜学科实验大棚。
大肠杆菌菌株DH5α，由本实验室保存；质粒载体pMD18T vector、Ex Taq 酶、反转录酶 Mlu I、dNTP荧光定量染料 SYBR Green I、DL marker2000DNA和胶回收试剂盒等购自大连 TaKaRa 公司。
1.2 DNA、RNA的提取及cDNA的合成
总DNA提取采用CTAB法，总RNA的提取采用Quick RNA Isolation Kit（北京华越洋公司）试剂盒提取。利用Prime Script RT reagent Kit（TaKaRa公司）将提取的总RNA反转录成cDNA。
1.3 胡萝卜ERFB31基因的克隆
根据的ERFB31基因设计一对引物，ZJR1：5’CTA，TGG，ATT，ACT，CGC，CGC，AAT 3’、ZJR2：5’ AAC，TGG，AAC，TGA，CCT，CCT，CTT3’。以‘黑田五寸’cDNA为模板分别进行扩增，PCR反应条件为：94℃预变性5 min，然后按照94℃变性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸1 min进行35个循环，最后72℃延伸10 min。用1.2%的琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物。回收后的PCR产物连接到T载体上，并转化到大肠杆菌DH5α。随后进行质粒的酶切与鉴定，委托南京金斯瑞生物科技有限公司进行DNA测序。
1.4 序列分析
核苷酸和蛋白序列BLAST比较搜索在NCBI（美国国立生物技术信息中心）网站相关程序中完成(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)；序列比对、氨基酸亲水/疏水性、组成成分和理化性质用DNAMAN软件及网站(http://www.expasy.org/)完成；用MEGA5对进化树进行测试和编辑并生成报告图形[13]；蛋白质空间结构模型通过SwissModel（http://swissmodel.expasy.org/）[14]建立。
1.5实时定量PCR反应
实时定量PCR按照SYBR Premix Ex Taq试剂盒操作说明进行。根据本文克隆的‘黑田五寸’胡萝卜中扩增的ERFB31基因序列设计表达检测引物为ZJR3：5’CTATGGATTACTCGCCGCAAT3’，ZJR4：3’TCTGCCTCACTCCCCTGTAA5。用胡萝卜actin基因作为内参基因，与目标基表达检测引物为ZJR7:5’CGGTATTGTGTTGGACTCTGGTGAT3’和ZJR6:3’CAGCAAGGTCAAGACGGAGTATGG5’。在 iQ?5 Realtime PCR System中完成荧光定量PCR（Relative quantitative realtime RTPCR）。扩增程序为：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，40个循环，然后利用iQ?5 software进行融解曲线分析。相对定量使用参照基因的ΔCT法，表达差异等于2ΔCT，ΔCT = CT,目标基因–CT, actin[17]。
2 结果分析
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
1材料与方法4
1.1试验材料、菌株与质粒4
1.2DNA、RNA的提取及cDNA的合成4
1.3胡萝卜ERFB31基因的克隆4
1.4序列分析 4
1.5实时定量PCR反应 5
2结果分析 5
2.1 胡萝卜ERFB31基因的克隆5
2.2 胡萝卜ERFB31转录因子的序列比对和进化树分析6
2.3 胡萝卜ERFB31转录因子推导氨基酸组成及理化性质7
2.4 胡萝卜ERFB31转录因子推导氨基酸亲水性/疏水性分析8
2.5 胡萝卜ERFB31蛋白的三级结构预测与分析9
2.6胡萝卜ERFB31基因在胡萝卜不同组织表达情况9
2.7 胡萝卜ERFB31基因在不同逆境处理下表达情况10
3 结论 10
致谢11
参考文献11
胡萝卜ERF转录因子基因的克隆与表达特性分析
引言
当植物受到环境中生物和非生物逆境胁迫时，一些基因能做出快速应答来避免植物受到逆境的伤害，转录因子（Transcription factors）是其中重要的一类调节因子。转录因子又
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥3^5`1^9`1^6^0`7^2$
称反式作用因子，是和专一性DNA序列结合并能激活或抑制其它基因转录的蛋白质分子[1]。AP2/ERF家族是植物中一类重要的转录因子，主要分为四个亚族，分别为DREB、ERF、AP2和RAV。ERF亚家族是植物转录因子中的一个大家族，在植物的生长、发育、抗病、抗胁迫以及次生代谢等方面都起着很重要的作用。
胡萝卜是伞形科胡萝卜属二年生草本植物。以肉质根作蔬菜食用。原产亚洲西南部，阿富汗为最早演化中心，栽培历史在2000年以上。胡萝卜一生中受到多种生物和非生物胁迫的伤害，其中非生物胁迫中的高温、低温、干旱、高盐等都严重影响了胡萝卜的产量和品质。为了避免逆境胁迫对胡萝卜的伤害，人们在胡萝卜生产栽培管理的措施与技术上做了大量的研究和推广，取得了很多的成效，但是对胡萝卜抗逆分子机理仍缺乏较为深刻的认识。
目前，胡萝卜的分子研究正处于起步和发展阶段，为了进一步研究胡萝卜逆境调控中转录因子的作用，本研究选取胡萝卜‘黑田五寸’，对其AP2/ERF家族转录因子ERFB31基因进行了克隆，并对其进行了较为详尽的序列、进化树和三级结构等方面的分析。利用荧光定量PCR进行了ERFB31基因组织特异表达研究。通过高温（38℃）、低温（4℃）、干旱胁迫（PEG）、盐胁迫（NaCL）处理，测定了‘黑田五寸’中ERFB31基因非生物胁迫诱导表达情况，以期为进一步深入研究胡萝卜AP2/ERF家族转录因子在胡萝卜生长发育和逆境调控中的作用提供借鉴。
1 材料与方法
1.1试验材料、菌株与质粒
供试材料为胡萝卜‘黑田五寸’的成熟植株，从一株植株上分别取根、茎、叶、等组织材料，进行各部位RNA的提取及cDNA的合成。并对未受病、虫侵害的植株进行胁迫处理：4℃低温、38℃高温、干旱处理、200mmol/L NaCl处理分别1、2、4、8、24h，提取叶片RNA进行反转录成cDNA，用于实时定量PCR。另外以黑田五寸叶片cDNA为模板进行ERF1基因的克隆。胡萝卜材料种植于大学园艺学院蔬菜学科实验大棚。
大肠杆菌菌株DH5α，由本实验室保存；质粒载体pMD18T vector、Ex Taq 酶、反转录酶 Mlu I、dNTP荧光定量染料 SYBR Green I、DL marker2000DNA和胶回收试剂盒等购自大连 TaKaRa 公司。
1.2 DNA、RNA的提取及cDNA的合成
总DNA提取采用CTAB法，总RNA的提取采用Quick RNA Isolation Kit（北京华越洋公司）试剂盒提取。利用Prime Script RT reagent Kit（TaKaRa公司）将提取的总RNA反转录成cDNA。
1.3 胡萝卜ERFB31基因的克隆
根据的ERFB31基因设计一对引物，ZJR1：5’CTA，TGG，ATT，ACT，CGC，CGC，AAT 3’、ZJR2：5’ AAC，TGG，AAC，TGA，CCT，CCT，CTT3’。以‘黑田五寸’cDNA为模板分别进行扩增，PCR反应条件为：94℃预变性5 min，然后按照94℃变性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸1 min进行35个循环，最后72℃延伸10 min。用1.2%的琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物。回收后的PCR产物连接到T载体上，并转化到大肠杆菌DH5α。随后进行质粒的酶切与鉴定，委托南京金斯瑞生物科技有限公司进行DNA测序。
1.4 序列分析
核苷酸和蛋白序列BLAST比较搜索在NCBI（美国国立生物技术信息中心）网站相关程序中完成(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)；序列比对、氨基酸亲水/疏水性、组成成分和理化性质用DNAMAN软件及网站(http://www.expasy.org/)完成；用MEGA5对进化树进行测试和编辑并生成报告图形[13]；蛋白质空间结构模型通过SwissModel（http://swissmodel.expasy.org/）[14]建立。
1.5实时定量PCR反应
实时定量PCR按照SYBR Premix Ex Taq试剂盒操作说明进行。根据本文克隆的‘黑田五寸’胡萝卜中扩增的ERFB31基因序列设计表达检测引物为ZJR3：5’CTATGGATTACTCGCCGCAAT3’，ZJR4：3’TCTGCCTCACTCCCCTGTAA5。用胡萝卜actin基因作为内参基因，与目标基表达检测引物为ZJR7:5’CGGTATTGTGTTGGACTCTGGTGAT3’和ZJR6:3’CAGCAAGGTCAAGACGGAGTATGG5’。在 iQ?5 Realtime PCR System中完成荧光定量PCR（Relative quantitative realtime RTPCR）。扩增程序为：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，40个循环，然后利用iQ?5 software进行融解曲线分析。相对定量使用参照基因的ΔCT法，表达差异等于2ΔCT，ΔCT = CT,目标基因–CT, actin[17]。
2 结果分析
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