酵母双杂交筛选菊花cmbbx22和cmbbx24互作蛋白的研究
菊花CmBBX24基因是B-Box家族中的成员，具有调控菊花开花时间和非生物胁迫抗性的作用，除此之外，还影响赤霉素的生物合成。然而，与之相互作用的蛋白知之甚少。本实验在之前用酵母双杂交的方法，从菊花‘神马’的花芽分化的cDNA文库中筛选出与CmBBX24互作蛋白CmBBX22的基础上，构建pGBKT7-CmBBX24诱饵表达载体，与pGADT7-CmBBX22共转化到酵母Y2H中，通过在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade 四缺培养基上报告基因表达的筛选，证明CmBBX24和CmBBX22存在互作。并通过基因枪法轰击洋葱表皮细胞，得知CmBBX24和CmBBX22表达的蛋白均定位在细胞核上。本实验为研究CmBBX22菊花的生物学功能奠定了基础。
目录
摘要 3
关键词 3
Abstract 3
Key words 3
引言 3
1 材料与方法 4
1.1 材料 4
1.2 方法 5
1.2.1 获得CmBBX22全长 5
1.2.2 构建CmBBX22的AD载体 5
1.2.3 构建CmBBX24及CmBBX24N的BD载体 7
1.2.4 构建pMDC43CmBBX24和pMDC43CmBBX22载体 8
1.2.5 亚细胞定位 8
1.2.6 转录激活活性分析 8
1.2.7 互作验证 9
2 结果与分析 9
2.1 CmBBX22全长获得 9
2.2 构建CmBBX22AD载体 9
2.3 构建CmBBX24及CmBBX24NBD载体 11
2.4 构建pMDC43CmBBX22和pMDC43CmBBX24载体 12
2.5 亚细胞定位 13
2.6 转录激活活性分析 13
2.7 互作验证 14
3 讨论 15
致谢 16
参考文献 16
图1 CmBBX22高保真PCR电泳结果.......................... *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
..........................................................9
图2 LA Taq PCR加酶切位点结果.......................................................................................10
图3 双酶切（BamH I&Not I）................................................................................................10
图4 重组质粒菌落PCR扩增结果........................................................................................10
图5 LA Taq PCR加酶切位点结果.......................................................................................11
图6 双酶切（EcoR I&Sal I）...................................................................................................11
图7 重组质粒菌落PCR扩增结果........................................................................................11
图8 重组质粒菌落PCR扩增结果........................................................................................12
图9 pMDC43CmBBX22重组质粒菌落PCR扩增结果......................................................12
图10 pMDC43CmBBX24重组质粒菌落PCR扩增结果....................................................12
图11 亚细胞定位..................................................................................................................13
图12 转录激活活性分析......................................................................................................14
图13 CmBBX24和CmBBX22互作验证.............................................................................15
酵母双杂交筛选菊花CmBBX22和CmBBX24互作蛋白的研究
引言
1989年，Fields[1]和Song提出并创立了一种直接用于酵母细胞内检测蛋白质之间相互作用的遗传学新方法一酵母双杂交系统。酵母双杂交系统的基础是真核生物调控转录起始过程，参与转录调控的转录激活因子在结构上是组件式的，由两个或两个以上相对独立的结构域组成：DNA结合结构域(binding domain，BD)和转录活化结构域(activition domain，AD)。两个结构域相互作用产生空间联系是转录激活的关键，而两者单独作用则无法激活转录过程。这一技术在细胞周期与分化、细胞凋亡、信号转导、癌基因产物功能、基因表达调控及蛋白自身特性等研究领域[2]受到越来越多的关注。
目录
摘要 3
关键词 3
Abstract 3
Key words 3
引言 3
1 材料与方法 4
1.1 材料 4
1.2 方法 5
1.2.1 获得CmBBX22全长 5
1.2.2 构建CmBBX22的AD载体 5
1.2.3 构建CmBBX24及CmBBX24N的BD载体 7
1.2.4 构建pMDC43CmBBX24和pMDC43CmBBX22载体 8
1.2.5 亚细胞定位 8
1.2.6 转录激活活性分析 8
1.2.7 互作验证 9
2 结果与分析 9
2.1 CmBBX22全长获得 9
2.2 构建CmBBX22AD载体 9
2.3 构建CmBBX24及CmBBX24NBD载体 11
2.4 构建pMDC43CmBBX22和pMDC43CmBBX24载体 12
2.5 亚细胞定位 13
2.6 转录激活活性分析 13
2.7 互作验证 14
3 讨论 15
致谢 16
参考文献 16
图1 CmBBX22高保真PCR电泳结果.......................... *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
..........................................................9
图2 LA Taq PCR加酶切位点结果.......................................................................................10
图3 双酶切（BamH I&Not I）................................................................................................10
图4 重组质粒菌落PCR扩增结果........................................................................................10
图5 LA Taq PCR加酶切位点结果.......................................................................................11
图6 双酶切（EcoR I&Sal I）...................................................................................................11
图7 重组质粒菌落PCR扩增结果........................................................................................11
图8 重组质粒菌落PCR扩增结果........................................................................................12
图9 pMDC43CmBBX22重组质粒菌落PCR扩增结果......................................................12
图10 pMDC43CmBBX24重组质粒菌落PCR扩增结果....................................................12
图11 亚细胞定位..................................................................................................................13
图12 转录激活活性分析......................................................................................................14
图13 CmBBX24和CmBBX22互作验证.............................................................................15
酵母双杂交筛选菊花CmBBX22和CmBBX24互作蛋白的研究
引言
1989年，Fields[1]和Song提出并创立了一种直接用于酵母细胞内检测蛋白质之间相互作用的遗传学新方法一酵母双杂交系统。酵母双杂交系统的基础是真核生物调控转录起始过程，参与转录调控的转录激活因子在结构上是组件式的，由两个或两个以上相对独立的结构域组成：DNA结合结构域(binding domain，BD)和转录活化结构域(activition domain，AD)。两个结构域相互作用产生空间联系是转录激活的关键，而两者单独作用则无法激活转录过程。这一技术在细胞周期与分化、细胞凋亡、信号转导、癌基因产物功能、基因表达调控及蛋白自身特性等研究领域[2]受到越来越多的关注。
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