茶树发育相关csgrf2基因克隆与功能鉴定
茶树(Camellia sinensis(L.)O. Kuntze)，属山茶科山茶属，为多年生常绿木本植物，用于在世界范围内生产非酒精性饮料。GROWTH-REGULATING FACTOR (GRF)生长调节因子是植物特有的蛋白，可以积极的调节叶发育。在本研究中，对茶树转录组中的CsGRF2基因进行了克隆和鉴定。实验结果表明，茶树的CsGRF2基因全长1,068 bp，编码355个氨基酸，编码一个QLQ和一个WRC结构域。通过蛋白质分析可知，茶树CsGRF2基因的理论相对分子质量为39,110，理论等电点pI为8.34，酸性氨基酸、碱性氨基酸、芳香族氨基酸和脂肪族氨基酸比例分别为9%、14%、9%和13%。CsGRF2基因的表达水平在嫩叶中较高，随茶树叶发育过程持续下降。这些结果表明，CsGRF2基因可能积极地参与了茶树叶早期的形成。此外，响应不同激素刺激的差异表达揭示了CsGRF2基因在激素调节中的多重功能。本研究为茶树GRF家族基因对叶的生长发育和对激素处理的反应提供一个潜在的分子基础。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1.1实验材料与处理 2
1.2 实验方法 3
1.2.1 总RNA的提取及cDNA的合成 3
1.2.2 茶树CsGRF2基因的克隆 4
1.2.3 序列分析 4
1.2.4 实时定量PCR(qRTPCR)检测 4
2 结果与分析 4
2.1 茶树CsGRF2基因的克隆 4
2.2 茶树CsGRF2基因编码氨基酸序列与不同物种的GRF蛋白氨基酸序列同源性比较分析 5
2.3茶树转录因子CsGRF2的系统进化树分析 7
2.4 茶树CsGRF2预测蛋白序列同其他物种的蛋白质理化特性分析 7
2.5 茶树叶发育过程中CsGRF2基因的表达 8
2.6 茶树CsGRF2基因在不同激素处理下的表达谱 9
3 讨论 9
3.1 实验结果 9
3.2 本实验存在的 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
不足和展望 10
致谢 10
参考文献： 11
图 1 茶树‘龙井43’叶片的不同发育阶段 3
图 2 茶树CsGRF2基因的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列 5
图 3 茶树CsGRF2转录因子同其他植物GRF类转录因子的氨基酸序列多重比对 6
图 4 茶树CsGRF2蛋白与其他植物GRF蛋白的系统进化分析 7
图 5 茶树叶片在不同发育阶段CsGRF2基因的相对表达水平 8
图 6 不同植物激素处理下茶树CsGRF2基因的相对表达水平 9
表 1 不同植物中GRF蛋白氨基酸组成及理化性质分析 8
茶树发育相关CsGRF2基因克隆与功能鉴定
引言
引言
茶，是中华民族的举国之饮，也是当今世界上最为流行的饮料。茶树，属山茶科山茶属，为多年生常绿木本植物，起源于东南亚地区，并先后传入日本、印度、斯里兰卡等50 多个国家，是全世界三大饮料作物之一。茶最初被人类认识是由于其可以食用，且有独特的药用价值，而后人们渐渐开始饮用它，认识到它的经济文化价值，历史上在我国经济文化交往中发挥了独特的作用。茶树叶是全球非酒精饮料生产的重要资源。茶能消食去腻、降火明目、宁心除烦、清暑解毒和生津止渴。茶叶中富含茶多酚、茶氨基、多糖等活性成分，具有很强的抗氧化性，据报道可以预防癌症、心血管和神经性疾病[1]。叶是植物能量和代谢的工厂，物质的积累和转化伴随着叶的发育过程而进行。随着人们对茶叶的认识和食用越来越广泛，对其的研究也不断深入，在基因组方面的研究已经取得长足进展。目前，对GRF基因的功能研究主要集中在拟南芥等草本植物中，研究发现，GRF基因参与植物的生长发育和代谢途径的调控，部分GRF家族基因编码的蛋白具有正向调控茎和叶生长发育的生物学功能，而AtGRF基因则具有抑制与拟南芥渗透压相关基因表达的负向调控作用[2]。1994年，Takeuchi等构建了第一个茶树cDNA文库，获得了许多重要的茶树基因[3]。黄建安等构件了国内首张茶树遗传图谱[4]。Shi等首次利用高通量测序技术获得茶树转录组深度数据库，为茶树研究基因表达、基因组和基因功能分析提供了重要的技术平台。许多研究表明，茶中有益化合物的基因调控发育相关性[5]。然而，有关茶树叶片发育的细胞和分子机制的研究还很缺乏。
GROWTHREGULATING FACTOR (GRF)生长调节因子是是植物特有的蛋白，分布于现已知的种子植物中，是与植物生长发育相关的转录因子[6,7,8]。2000年在水稻中被首次发现，并命名为OsGRF1[9]。GRF蛋白的特征是在N端有以下两个保守区域：QLQ(Gln，Leu，Gln)和WRC (Trp，Arg，Cys)结构域[10]。QLQ域具有蛋白互作功能，因为该领域的结构类似于酵母菌SWI2/SNF2蛋白质的N末端区域，与SNF11相互作用[11]。WRC域包含一个核定位信号和一个用于绑定DNA的C3H型锌指结构[9]。此外，在一些GRF蛋白的C末端区域中有3个较小的特征结构(FFD、TQL和GGPL)[12]。GRF蛋白可以通过QLQ域与GIF蛋白的SNH域相互作用形成功能复合体[13,14]。
GRF蛋白对细胞增殖和膨大有正向调节作用，参与叶片的形成[15]。通过对拟南芥GRF基因异常表达的研究，发现GRF基因参与叶表型的表达。单基因的超表达(AtGRF2、AtGRF3、AtGRF5)会导致比对照组更大的叶片[16]，突变体(atgrf1/2/3，atgrf3，atgrf4和atgrf5)形成更小更窄的叶片[17]。此外，GRF蛋白还参与了开花、种子形成和根系发育过程。GRF基因在叶生长发育的调节网络中还受到miR396的调控。在转录后水平，miR396通过专门识别和结合GRF转录本来抑制或降解GRF靶基因[17]。
在本项研究中，基于茶树叶转录组克隆并鉴定了CsGRF2基因[18]。对CsGRF2基因家族的序列进行了对比、进化树等生物信息学分析，并采用实时荧光定量PCR(qRTPCR)的方法检测了CsGRF2基因在茶树叶片发育过程中以及响应不同激素处理的表达水平。本研究旨在揭示茶树叶发育的遗传网络并为茶树对激素刺激的响应提供潜在的分子基础。
1 材料与方法
1.1实验材料与处理
供试对象为大学园艺学院茶叶科学研究所种植的茶树品种‘龙井43’(C. sinensis cv. ‘Longjing43’)，取2年生无病虫害扦插苗的幼嫩叶片提取cDNA?
生长环境条件:实验室设定了相对湿度为70 ± 10%，光照强度为300 μmolm2s1，白天照射16小时(25 °C)，夜间照射8小时(16 °C)?选用不同发育阶段，即，第一?第二?第三?第四?和老叶作为实验材料(图1)?老叶是第一年发育的叶子，此外，统一选取第三叶为激素处理的材料?详情如下：叶片上喷洒1 mM的赤霉素(GA3处理）；1 mM的3吲哚乙酸(IAA处理)；1 mM的水杨酸(SA处理)；1 mM的茉莉酸甲酯(MeJA处理)；0.1 mM的脱落酸(ABA处理)，在2h后采摘处理叶片?GA3?IAA?SA和MeJA溶解于含有2%纯乙醇的蒸馏水中，而ABA则仅溶解于蒸馏水中?用蒸馏水+2%纯乙醇的叶片，作为GA3?IAA?SA和MeJA处理的对照组，而只喷洒过蒸馏水的则被用作ABA处理的对照组?每种处理制备3个实验重复?茶树叶片材料收集后迅速浸入液氮中，并在–80 °C条件下储存用于RNA的提取?
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1.1实验材料与处理 2
1.2 实验方法 3
1.2.1 总RNA的提取及cDNA的合成 3
1.2.2 茶树CsGRF2基因的克隆 4
1.2.3 序列分析 4
1.2.4 实时定量PCR(qRTPCR)检测 4
2 结果与分析 4
2.1 茶树CsGRF2基因的克隆 4
2.2 茶树CsGRF2基因编码氨基酸序列与不同物种的GRF蛋白氨基酸序列同源性比较分析 5
2.3茶树转录因子CsGRF2的系统进化树分析 7
2.4 茶树CsGRF2预测蛋白序列同其他物种的蛋白质理化特性分析 7
2.5 茶树叶发育过程中CsGRF2基因的表达 8
2.6 茶树CsGRF2基因在不同激素处理下的表达谱 9
3 讨论 9
3.1 实验结果 9
3.2 本实验存在的 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
不足和展望 10
致谢 10
参考文献： 11
图 1 茶树‘龙井43’叶片的不同发育阶段 3
图 2 茶树CsGRF2基因的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列 5
图 3 茶树CsGRF2转录因子同其他植物GRF类转录因子的氨基酸序列多重比对 6
图 4 茶树CsGRF2蛋白与其他植物GRF蛋白的系统进化分析 7
图 5 茶树叶片在不同发育阶段CsGRF2基因的相对表达水平 8
图 6 不同植物激素处理下茶树CsGRF2基因的相对表达水平 9
表 1 不同植物中GRF蛋白氨基酸组成及理化性质分析 8
茶树发育相关CsGRF2基因克隆与功能鉴定
引言
引言
茶，是中华民族的举国之饮，也是当今世界上最为流行的饮料。茶树，属山茶科山茶属，为多年生常绿木本植物，起源于东南亚地区，并先后传入日本、印度、斯里兰卡等50 多个国家，是全世界三大饮料作物之一。茶最初被人类认识是由于其可以食用，且有独特的药用价值，而后人们渐渐开始饮用它，认识到它的经济文化价值，历史上在我国经济文化交往中发挥了独特的作用。茶树叶是全球非酒精饮料生产的重要资源。茶能消食去腻、降火明目、宁心除烦、清暑解毒和生津止渴。茶叶中富含茶多酚、茶氨基、多糖等活性成分，具有很强的抗氧化性，据报道可以预防癌症、心血管和神经性疾病[1]。叶是植物能量和代谢的工厂，物质的积累和转化伴随着叶的发育过程而进行。随着人们对茶叶的认识和食用越来越广泛，对其的研究也不断深入，在基因组方面的研究已经取得长足进展。目前，对GRF基因的功能研究主要集中在拟南芥等草本植物中，研究发现，GRF基因参与植物的生长发育和代谢途径的调控，部分GRF家族基因编码的蛋白具有正向调控茎和叶生长发育的生物学功能，而AtGRF基因则具有抑制与拟南芥渗透压相关基因表达的负向调控作用[2]。1994年，Takeuchi等构建了第一个茶树cDNA文库，获得了许多重要的茶树基因[3]。黄建安等构件了国内首张茶树遗传图谱[4]。Shi等首次利用高通量测序技术获得茶树转录组深度数据库，为茶树研究基因表达、基因组和基因功能分析提供了重要的技术平台。许多研究表明，茶中有益化合物的基因调控发育相关性[5]。然而，有关茶树叶片发育的细胞和分子机制的研究还很缺乏。
GROWTHREGULATING FACTOR (GRF)生长调节因子是是植物特有的蛋白，分布于现已知的种子植物中，是与植物生长发育相关的转录因子[6,7,8]。2000年在水稻中被首次发现，并命名为OsGRF1[9]。GRF蛋白的特征是在N端有以下两个保守区域：QLQ(Gln，Leu，Gln)和WRC (Trp，Arg，Cys)结构域[10]。QLQ域具有蛋白互作功能，因为该领域的结构类似于酵母菌SWI2/SNF2蛋白质的N末端区域，与SNF11相互作用[11]。WRC域包含一个核定位信号和一个用于绑定DNA的C3H型锌指结构[9]。此外，在一些GRF蛋白的C末端区域中有3个较小的特征结构(FFD、TQL和GGPL)[12]。GRF蛋白可以通过QLQ域与GIF蛋白的SNH域相互作用形成功能复合体[13,14]。
GRF蛋白对细胞增殖和膨大有正向调节作用，参与叶片的形成[15]。通过对拟南芥GRF基因异常表达的研究，发现GRF基因参与叶表型的表达。单基因的超表达(AtGRF2、AtGRF3、AtGRF5)会导致比对照组更大的叶片[16]，突变体(atgrf1/2/3，atgrf3，atgrf4和atgrf5)形成更小更窄的叶片[17]。此外，GRF蛋白还参与了开花、种子形成和根系发育过程。GRF基因在叶生长发育的调节网络中还受到miR396的调控。在转录后水平，miR396通过专门识别和结合GRF转录本来抑制或降解GRF靶基因[17]。
在本项研究中，基于茶树叶转录组克隆并鉴定了CsGRF2基因[18]。对CsGRF2基因家族的序列进行了对比、进化树等生物信息学分析，并采用实时荧光定量PCR(qRTPCR)的方法检测了CsGRF2基因在茶树叶片发育过程中以及响应不同激素处理的表达水平。本研究旨在揭示茶树叶发育的遗传网络并为茶树对激素刺激的响应提供潜在的分子基础。
1 材料与方法
1.1实验材料与处理
供试对象为大学园艺学院茶叶科学研究所种植的茶树品种‘龙井43’(C. sinensis cv. ‘Longjing43’)，取2年生无病虫害扦插苗的幼嫩叶片提取cDNA?
生长环境条件:实验室设定了相对湿度为70 ± 10%，光照强度为300 μmolm2s1，白天照射16小时(25 °C)，夜间照射8小时(16 °C)?选用不同发育阶段，即，第一?第二?第三?第四?和老叶作为实验材料(图1)?老叶是第一年发育的叶子，此外，统一选取第三叶为激素处理的材料?详情如下：叶片上喷洒1 mM的赤霉素(GA3处理）；1 mM的3吲哚乙酸(IAA处理)；1 mM的水杨酸(SA处理)；1 mM的茉莉酸甲酯(MeJA处理)；0.1 mM的脱落酸(ABA处理)，在2h后采摘处理叶片?GA3?IAA?SA和MeJA溶解于含有2%纯乙醇的蒸馏水中，而ABA则仅溶解于蒸馏水中?用蒸馏水+2%纯乙醇的叶片，作为GA3?IAA?SA和MeJA处理的对照组，而只喷洒过蒸馏水的则被用作ABA处理的对照组?每种处理制备3个实验重复?茶树叶片材料收集后迅速浸入液氮中，并在–80 °C条件下储存用于RNA的提取?
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