胡萝卜抗坏血酸过氧化物酶dcapx基因的克隆与分析表达
摘要：胡萝卜是一种世界性栽培蔬菜，以其丰富的营养品质广受人们喜爱，但在其生长发育期间，经常会受到高温、低温、干旱、盐害等不利环境的侵袭，最终影响产量和品质。抗坏血酸过氧化物酶（ascorbate peroxidase, APX）利用抗坏血酸作为电子供体，清除植物中的过氧化物，在植物应对非生物胁迫中起重要作用。本试验以胡萝卜品种“黑田五寸”为研究材料，克隆获得胡萝卜APX基因，并对该基因进行了较为详尽的序列分析，利用实时定量PCR技术对其逆境条件下的表达进行了研究，以期明确胡萝卜APX基因在抵御逆境胁迫过程中的作用。本试验是第一次从胡萝卜中克隆获得该类基因，对于揭示和发掘胡萝卜抗逆能力、提高产量和品质以及进一步研究伞形科植物APX有较为重要的意义。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.2 试验方法 2
1.2.1 RNA的提取及cDNA的合成2
1.2.2 胡萝卜DcAPX基因的克隆2
1.2.3 序列分析2
1.2.4 实时定量PCR2
1.2.5数据分析 2
2 结果与分析3
2.1 胡萝卜DcAPX基因的克隆3
2.2 胡萝卜DcAPX基因的氨基酸序列分析与理化性质分析4
2.3 胡萝卜DcAPX基因在不同非生物胁迫下的表达6
3 讨论 7
致谢9
参考文献10
图1 RTPCR克隆胡萝卜DcAPX基因3
图2 “黑田五寸”DcAPX基因的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列3
图3 胡萝卜及其他植物的APX氨基酸序列 4
图4 “黑田五寸”中DcAPX基因在不同逆境条件下的表达水平7
表1 “黑田五寸”及其他植物的DcAPX氨基酸序列的理化性质分析5
胡萝卜抗坏血酸过氧化物酶DcAPX基因的克隆与表达分析
引言
植物生长发育期间，干旱、盐害、高温或低温等非生物胁迫会损伤植物细胞，引起渗透和氧化胁
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迫等次生伤害，继而影响渗透调节和离子平衡，产生大量活性氧（ROS），破坏膜系统结构和功能，严重阻碍植物正常生长和发育[1]。为了响应和抵御不利环境产生的氧化胁迫，植物自身形成了一系列防御机制来清除或降低活性氧产生的毒性。
抗坏血酸过氧化物酶（APX）是抗坏血酸（ascorbic acid, AsA）—谷胱甘肽（glutathione, GSH）循环过程中的关键酶[2]，主要存在于植物细胞质、叶绿体、过氧化物酶体和线粒体中，它可以利用抗坏血酸作为电子供体，清除植物中过量的过氧化物[3]。前人研究表明，抗坏血酸过氧化物酶与植物生长和抵抗逆境胁迫有着密切的联系[4]。目前，从草莓[5]、番茄[6]、烟草[7]、小麦[8]等植物中的研究已经证实，APX基因可能参与植物生长发育和多种逆境胁迫过程。
胡萝卜（Daucus carota L.）属于伞形科二年生草本植物，是一种世界性的重要栽培蔬菜，具有丰富的营养品质。胡萝卜生长发育期间，经常会受到高温、低温、干旱、盐害等不利环境的侵袭，最终影响胡萝卜的产量和品质。因此研究胡萝卜非生物胁迫响应相关基因对于揭示和发掘胡萝卜抗逆能力、提高其产量和品质具有重要意义。
本试验以胡萝卜品种“黑田五寸”为研究材料，克隆获得胡萝卜APX基因，并对该基因进行了较为详尽的序列分析，利用实时定量PCR技术对其逆境条件下的表达进行了研究。因此研究抗逆相关基因对于揭示和发掘胡萝卜抗逆能力、提高其产量和品质以及伞形科植物APX具有重要意义。
1 材料与方法
1.1 材料
大肠杆菌菌株为本实验室保存；质粒载体pMD18T、Ex Taq聚合酶、DNA回收试剂盒、DL marker2000、Prime Script RT reagent Kit、SYBR Premix Ex Taq kit购自大连TaKaRa公司，RNA simple Total RNA Kit购于北京天根生化科技有限公司。供试胡萝卜品种为“黑田五寸”，种植于大学作物遗传与种质创新国家重点实验室人工气候室，取2月龄的植株进行逆境处理（包括38℃高温、4℃ 低温、20% PEG干旱和20% NaCl盐处理），植物叶片用于RNA的提取以及cDNA的合成。
1.2 试验方法
1.2.1 RNA的提取及cDNA的合成
采用RNA simple Total RNA Kit（Tiangen公司）提取总RNA，利用Prime Script RT reagent Kit（TaKaRa公司）将提取的总RNA反转录成cDNA。
1.2.2 胡萝卜DcAPX基因的克隆
根据本实验室测定的胡萝卜“黑田五寸”基因组数据，检索并拼接出胡萝卜抗坏血酸过氧化物酶DcAPX序列，设计一对引物DcAPXF和DcAPXR，序列分别为5’ ATGGGAAAGTGCTACCCAACAGTGAG3’和5’TTAAGCCTCAGCAAACCCAAGTTCAG3’。以“黑田五寸”cDNA为模板进行扩增，PCR反应程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物用质量体积分数1.2%琼脂糖凝胶电泳回收目的条带，与pMD18T载体连接过夜，并转化至大肠杆菌DH5α中，提取质粒经PCR鉴定后委托南京金斯瑞生物科技有限公司测序。
1.2.3 序列分析
其他植物的APX序列均来自于NCBI数据库，使用BLAST进行序列比对,并用软件DNAMAN对序列进行多重对比。使用http:// www.expasy.org网站相关软件完成蛋白质基本性质分析[9,10]。
1.2.4 实时定量PCR
荧光定量PCR采用ABI 7300 Realtime PCR System和7300 System software完成。用胡萝卜actin基因作为参考基因，与目标基因一起扩增，表达检测引物为ACTINF: 5’ CGGTATTGTGTTGGACTCTGGTGAT3’和ACTINR:5’ CAGCAAGGTCAAGACGGAGTATGG3’。根据从“黑田五寸”中扩增的DcAPX序列设计表达检测引物BDDcAPXF: 5’AACAGTGAGCGAGGAGTACAAGGT3’和BDDcAPXR: 5’ CAAGACGAAGCATAAGAGGAGCACAA3’。采用SYBR Premix Ex Taq试剂盒并按照操作说明进行实时定量PCR。以胡萝卜actin基因的转录表达水平作为内参，计算目的基因相对表达水平2－??Ct。其中??Ct=（Ct靶基因－Ct内参）处理组－（Ct靶基因－Ct内参）对照组。
1.2.5 数据分析
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摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.2 试验方法 2
1.2.1 RNA的提取及cDNA的合成2
1.2.2 胡萝卜DcAPX基因的克隆2
1.2.3 序列分析2
1.2.4 实时定量PCR2
1.2.5数据分析 2
2 结果与分析3
2.1 胡萝卜DcAPX基因的克隆3
2.2 胡萝卜DcAPX基因的氨基酸序列分析与理化性质分析4
2.3 胡萝卜DcAPX基因在不同非生物胁迫下的表达6
3 讨论 7
致谢9
参考文献10
图1 RTPCR克隆胡萝卜DcAPX基因3
图2 “黑田五寸”DcAPX基因的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列3
图3 胡萝卜及其他植物的APX氨基酸序列 4
图4 “黑田五寸”中DcAPX基因在不同逆境条件下的表达水平7
表1 “黑田五寸”及其他植物的DcAPX氨基酸序列的理化性质分析5
胡萝卜抗坏血酸过氧化物酶DcAPX基因的克隆与表达分析
引言
植物生长发育期间，干旱、盐害、高温或低温等非生物胁迫会损伤植物细胞，引起渗透和氧化胁
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迫等次生伤害，继而影响渗透调节和离子平衡，产生大量活性氧（ROS），破坏膜系统结构和功能，严重阻碍植物正常生长和发育[1]。为了响应和抵御不利环境产生的氧化胁迫，植物自身形成了一系列防御机制来清除或降低活性氧产生的毒性。
抗坏血酸过氧化物酶（APX）是抗坏血酸（ascorbic acid, AsA）—谷胱甘肽（glutathione, GSH）循环过程中的关键酶[2]，主要存在于植物细胞质、叶绿体、过氧化物酶体和线粒体中，它可以利用抗坏血酸作为电子供体，清除植物中过量的过氧化物[3]。前人研究表明，抗坏血酸过氧化物酶与植物生长和抵抗逆境胁迫有着密切的联系[4]。目前，从草莓[5]、番茄[6]、烟草[7]、小麦[8]等植物中的研究已经证实，APX基因可能参与植物生长发育和多种逆境胁迫过程。
胡萝卜（Daucus carota L.）属于伞形科二年生草本植物，是一种世界性的重要栽培蔬菜，具有丰富的营养品质。胡萝卜生长发育期间，经常会受到高温、低温、干旱、盐害等不利环境的侵袭，最终影响胡萝卜的产量和品质。因此研究胡萝卜非生物胁迫响应相关基因对于揭示和发掘胡萝卜抗逆能力、提高其产量和品质具有重要意义。
本试验以胡萝卜品种“黑田五寸”为研究材料，克隆获得胡萝卜APX基因，并对该基因进行了较为详尽的序列分析，利用实时定量PCR技术对其逆境条件下的表达进行了研究。因此研究抗逆相关基因对于揭示和发掘胡萝卜抗逆能力、提高其产量和品质以及伞形科植物APX具有重要意义。
1 材料与方法
1.1 材料
大肠杆菌菌株为本实验室保存；质粒载体pMD18T、Ex Taq聚合酶、DNA回收试剂盒、DL marker2000、Prime Script RT reagent Kit、SYBR Premix Ex Taq kit购自大连TaKaRa公司，RNA simple Total RNA Kit购于北京天根生化科技有限公司。供试胡萝卜品种为“黑田五寸”，种植于大学作物遗传与种质创新国家重点实验室人工气候室，取2月龄的植株进行逆境处理（包括38℃高温、4℃ 低温、20% PEG干旱和20% NaCl盐处理），植物叶片用于RNA的提取以及cDNA的合成。
1.2 试验方法
1.2.1 RNA的提取及cDNA的合成
采用RNA simple Total RNA Kit（Tiangen公司）提取总RNA，利用Prime Script RT reagent Kit（TaKaRa公司）将提取的总RNA反转录成cDNA。
1.2.2 胡萝卜DcAPX基因的克隆
根据本实验室测定的胡萝卜“黑田五寸”基因组数据，检索并拼接出胡萝卜抗坏血酸过氧化物酶DcAPX序列，设计一对引物DcAPXF和DcAPXR，序列分别为5’ ATGGGAAAGTGCTACCCAACAGTGAG3’和5’TTAAGCCTCAGCAAACCCAAGTTCAG3’。以“黑田五寸”cDNA为模板进行扩增，PCR反应程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物用质量体积分数1.2%琼脂糖凝胶电泳回收目的条带，与pMD18T载体连接过夜，并转化至大肠杆菌DH5α中，提取质粒经PCR鉴定后委托南京金斯瑞生物科技有限公司测序。
1.2.3 序列分析
其他植物的APX序列均来自于NCBI数据库，使用BLAST进行序列比对,并用软件DNAMAN对序列进行多重对比。使用http:// www.expasy.org网站相关软件完成蛋白质基本性质分析[9,10]。
1.2.4 实时定量PCR
荧光定量PCR采用ABI 7300 Realtime PCR System和7300 System software完成。用胡萝卜actin基因作为参考基因，与目标基因一起扩增，表达检测引物为ACTINF: 5’ CGGTATTGTGTTGGACTCTGGTGAT3’和ACTINR:5’ CAGCAAGGTCAAGACGGAGTATGG3’。根据从“黑田五寸”中扩增的DcAPX序列设计表达检测引物BDDcAPXF: 5’AACAGTGAGCGAGGAGTACAAGGT3’和BDDcAPXR: 5’ CAAGACGAAGCATAAGAGGAGCACAA3’。采用SYBR Premix Ex Taq试剂盒并按照操作说明进行实时定量PCR。以胡萝卜actin基因的转录表达水平作为内参，计算目的基因相对表达水平2－??Ct。其中??Ct=（Ct靶基因－Ct内参）处理组－（Ct靶基因－Ct内参）对照组。
1.2.5 数据分析
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