胡萝卜抗冻蛋白基因的克隆与表达载体构建
摘要：低温是限制植物生长和分布的一种非生物胁迫因素，给农业生产带来了很大损失，因此提高植物抗寒性对农业生产具有极大意义。随着分子生物学的发展，用基因工程的方法培育抗寒植物正以其周期短、见效快的优点而逐渐在植物遗传育种中占有重要地位。为对胡萝卜抗冻蛋白进行功能研究，从胡萝卜中分离出AFP基因，构建植物表达载体。结果表明，本实验成功克隆出了抗冻蛋白基因AFP，并构建了植物表达载体，为进一步转化园艺植物打下基础。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1.1实验材料 2
1.1.1植物材料 2
1.1.2菌种和质粒 2
1.1.3主要试剂 2
1.1.4 PCR引物设计 2
1.1.5 培养基 2
1.2 实验方法 3
1.2.1胡萝卜总RNA的提取` 3
1.2.2胡萝卜抗冻蛋白AFP基因扩增 3
1.2.3目的片段的回收 3
1.2.4目的片段与载体连接 3
1.2.5大肠杆菌感受态转化 3
1.2.6质粒DNA的提取 4
1.2.7重组质粒的序列测序 4
1.2.8植物表达载体的构建 4
2 结果与分析 5
2.1胡萝卜总RNA的提取与目的片段的PCR扩增及回收 5
2.2胡萝卜中AFP表达分布 6
2.3目的片段在重组质粒中的PCR鉴定 6
2.4 DcAFP基因序列分析 6
2.5 AFP抗冻蛋白载体构建 6
2.6 重组质粒鉴定 7
3 讨论 8
致谢 8
参考文献 8
胡萝卜抗冻蛋白基因的克隆与表达载体构建
引言
引言：低温冻害是常见自然灾害，往往给生产带来严重的经济损失。自从1969年，Devries在北极鱼（Trematomus borohgrevinki）的血液中首次发现抗冻蛋白以来，国内外学者便致力于用
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
转化鱼类AFP基因的方法来提高植物抗寒性[1,2]。根据鱼类抗冻蛋白AFP结构的不同将其分为四大类，其中尤其以美洲拟鲽AFP为代表的第一类抗冻蛋白活性较强[2]。但由于植物和动物各方面相差太远，研究结果并不理想[3,4,5]。直至1992 年，Griffith等[6] 第一次明确提出获得植物内源 AFPs，这一发现使得植物低温冻害方面的研究有了重大突破。随后，人们先后将AFP通过转基因技术转入烟草[7]、玉米[8]、番茄[9]等作物中，已得到初步结果。
胡萝卜属约有60种，主产欧洲地中海一带和亚洲温带地区，北美洲及大洋洲有数种分布。1998年，Worrall等[10]发表了胡萝卜（Daucus carota）AFPs，标志着第一个植物AFP基因的发现。2001年，尹明安等[11]成功克隆了中国胡萝卜和英国胡萝卜的AFP基因。抗冻蛋白可以增强作物在田间的抗冻能力，并改善作物的贮藏加工特性[12]。
胡萝卜质脆味美，具有多种营养价值，深受百姓喜爱，在我国南北方均有栽培，种植面积广，产量占根菜类的第二位，因此，抗冻蛋白的发现及AFP基因的成功克隆对胡萝卜育种以及种质资源创新具有重要参考意义。
本试验以胡萝卜自交系品种‘黑田五寸’（Daucus carota L. Cv. Heitian wucun)为实验材料，克隆得到AFP基因，对其进行序列检测，构建植物表达载体，为进一步利用其转化拟南芥、番茄等作物打下实验基础。
1 材料与方法
1.1实验材料
1.1.1植物材料
植物材料为胡萝卜自交系品种‘黑田五寸’。
1.1.2 菌种和质粒
宿主菌E.coli DH5ɑ、植物表达载体质粒pYN7736、农杆菌菌株EHA105由大学伞形科蔬菜课题组提供，TVector pMD19(simple)载体购自大连TaKaRa公司。
1.1.3主要试剂
RNA提取试剂盒、DNA Maker、TAE缓冲液、琼脂糖、氨苄青霉素（Amp）、卡那霉素（Kana）、利福平（Rif）、T4连接酶。
1.1.4 PCR引物设计
从GenBank数据库中查找胡萝卜AFP基因序列，利用PrimerPremier5.0软件，设计引物，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。
表1 引物序列
Tab.1 The Sequence of Primers
引物(Primers)
序列(Sequence)
DcAFPF
CGGATCCATGAATATTGAATCATCTTTC
DcAFPR
CGAGCTCGCATTCTGGCAATGGAGC
1F
ACTCCAAATCAAACAGACGTG
1R
GTTCGGGTATGGTAGGTATC
DcActinF
CGGTATTGTGTTGGACTCTGGTGAT
DcActinR
CAGCAAGGTCAAGACGGAGTATGG
1.1.5 培养基
LB培养基：在800mL蒸馏水中溶解10g蛋白胨、5g酵母提取物、10g氯化钠，用NaOH调至pH7.0，加水定容至1L，高温高压灭菌30min。
氨苄青霉素（Amp）：称取0.5gAmp于10mL离心管中，加入4mL蒸馏水，充分混合溶解后定容至5mL，用0.22um滤膜过滤，20℃保存备用。
卡那霉素（Kana）：称取0.25g卡那霉素置于10mL离心管中，加入4mL蒸馏水，充分混合溶解后定容至5mL，用0.22um滤膜过滤，20℃保存备用。
1.2 实验方法
1.2.1胡萝卜总RNA的提取`
采用总RNA试剂盒（Tiangen 公司）提取总RNA，利用反转录试剂盒（TaKaRa公司)将提取的胡萝卜总RNA反转录成cDNA。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1.1实验材料 2
1.1.1植物材料 2
1.1.2菌种和质粒 2
1.1.3主要试剂 2
1.1.4 PCR引物设计 2
1.1.5 培养基 2
1.2 实验方法 3
1.2.1胡萝卜总RNA的提取` 3
1.2.2胡萝卜抗冻蛋白AFP基因扩增 3
1.2.3目的片段的回收 3
1.2.4目的片段与载体连接 3
1.2.5大肠杆菌感受态转化 3
1.2.6质粒DNA的提取 4
1.2.7重组质粒的序列测序 4
1.2.8植物表达载体的构建 4
2 结果与分析 5
2.1胡萝卜总RNA的提取与目的片段的PCR扩增及回收 5
2.2胡萝卜中AFP表达分布 6
2.3目的片段在重组质粒中的PCR鉴定 6
2.4 DcAFP基因序列分析 6
2.5 AFP抗冻蛋白载体构建 6
2.6 重组质粒鉴定 7
3 讨论 8
致谢 8
参考文献 8
胡萝卜抗冻蛋白基因的克隆与表达载体构建
引言
引言：低温冻害是常见自然灾害，往往给生产带来严重的经济损失。自从1969年，Devries在北极鱼（Trematomus borohgrevinki）的血液中首次发现抗冻蛋白以来，国内外学者便致力于用
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转化鱼类AFP基因的方法来提高植物抗寒性[1,2]。根据鱼类抗冻蛋白AFP结构的不同将其分为四大类，其中尤其以美洲拟鲽AFP为代表的第一类抗冻蛋白活性较强[2]。但由于植物和动物各方面相差太远，研究结果并不理想[3,4,5]。直至1992 年，Griffith等[6] 第一次明确提出获得植物内源 AFPs，这一发现使得植物低温冻害方面的研究有了重大突破。随后，人们先后将AFP通过转基因技术转入烟草[7]、玉米[8]、番茄[9]等作物中，已得到初步结果。
胡萝卜属约有60种，主产欧洲地中海一带和亚洲温带地区，北美洲及大洋洲有数种分布。1998年，Worrall等[10]发表了胡萝卜（Daucus carota）AFPs，标志着第一个植物AFP基因的发现。2001年，尹明安等[11]成功克隆了中国胡萝卜和英国胡萝卜的AFP基因。抗冻蛋白可以增强作物在田间的抗冻能力，并改善作物的贮藏加工特性[12]。
胡萝卜质脆味美，具有多种营养价值，深受百姓喜爱，在我国南北方均有栽培，种植面积广，产量占根菜类的第二位，因此，抗冻蛋白的发现及AFP基因的成功克隆对胡萝卜育种以及种质资源创新具有重要参考意义。
本试验以胡萝卜自交系品种‘黑田五寸’（Daucus carota L. Cv. Heitian wucun)为实验材料，克隆得到AFP基因，对其进行序列检测，构建植物表达载体，为进一步利用其转化拟南芥、番茄等作物打下实验基础。
1 材料与方法
1.1实验材料
1.1.1植物材料
植物材料为胡萝卜自交系品种‘黑田五寸’。
1.1.2 菌种和质粒
宿主菌E.coli DH5ɑ、植物表达载体质粒pYN7736、农杆菌菌株EHA105由大学伞形科蔬菜课题组提供，TVector pMD19(simple)载体购自大连TaKaRa公司。
1.1.3主要试剂
RNA提取试剂盒、DNA Maker、TAE缓冲液、琼脂糖、氨苄青霉素（Amp）、卡那霉素（Kana）、利福平（Rif）、T4连接酶。
1.1.4 PCR引物设计
从GenBank数据库中查找胡萝卜AFP基因序列，利用PrimerPremier5.0软件，设计引物，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。
表1 引物序列
Tab.1 The Sequence of Primers
引物(Primers)
序列(Sequence)
DcAFPF
CGGATCCATGAATATTGAATCATCTTTC
DcAFPR
CGAGCTCGCATTCTGGCAATGGAGC
1F
ACTCCAAATCAAACAGACGTG
1R
GTTCGGGTATGGTAGGTATC
DcActinF
CGGTATTGTGTTGGACTCTGGTGAT
DcActinR
CAGCAAGGTCAAGACGGAGTATGG
1.1.5 培养基
LB培养基：在800mL蒸馏水中溶解10g蛋白胨、5g酵母提取物、10g氯化钠，用NaOH调至pH7.0，加水定容至1L，高温高压灭菌30min。
氨苄青霉素（Amp）：称取0.5gAmp于10mL离心管中，加入4mL蒸馏水，充分混合溶解后定容至5mL，用0.22um滤膜过滤，20℃保存备用。
卡那霉素（Kana）：称取0.25g卡那霉素置于10mL离心管中，加入4mL蒸馏水，充分混合溶解后定容至5mL，用0.22um滤膜过滤，20℃保存备用。
1.2 实验方法
1.2.1胡萝卜总RNA的提取`
采用总RNA试剂盒（Tiangen 公司）提取总RNA，利用反转录试剂盒（TaKaRa公司)将提取的胡萝卜总RNA反转录成cDNA。
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