脱落酸对藤稔葡萄果实成熟调控的研究
摘要：葡萄是世界上栽培历史悠久，经济价值很高的果树，在果树中栽培面积居世界第一。果实成熟调控的研究一直是果树学科的一个重点问题。前人研究证明脱落酸ABA（abscisic acid）是调控非呼吸跃变型果实葡萄成熟的核心组分，但对葡萄果实的研究大都集中在赤霉素对果实的发育调控，而对脱落酸调控葡萄果实的研究很少。本研究以藤稔葡萄为试材，通过对葡萄发育过程中果实大小、酸度、果实单重、干物质含量、三种可溶性糖（蔗糖、葡萄糖、果糖）等生理指标和相关基因的分析，了解ABA对果实成熟进程的影响，以及对果实上色成熟相关基因的调控，进一步分析脱落酸对葡萄果实成熟的调控作用。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract. 1
Key words 1
引言 1
1 试验材料 2
1.1 材料及其处理 2
1.2 取样 2
2 方法 3
2.1 生理指标测定与方法 3
2.1.1 果实重量、大小及干物质含量 3
2.1.2 可溶性糖含量 3
2.1.3 果实酸度 3
2.2 果实生长及成熟过程中相关基因表达分析 3
2.2.1 葡萄果肉、果皮总RNA的提取 3
2.2.2 总RNA中DNA的消化 4
2.2.3 CDNA第一链的合成与质量检测 4
2.2.4 RTPCR 5
3 结果与分析 6
3.1 果实发育过程中生理指标的变化 6
3.1.1 果实形状、单果重及干物质含量变化 7
3.1.2 果皮与果肉中三种可溶性糖含量 8
3.1.3 果实酸度变化 10
3.2 脱落酸对果实生长发育的影响 10
3.3 脱落酸与果实着色 12
3.4 葡萄中部分成熟相关基因的表达分析 13
3.4.1 葡萄各组织总RNA提取及纯度检测 13
3.4.2 CDNA质量检测 14
3.4.3 葡萄中两种代谢相关基因的表达量分析 14
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
3.4.4 脱落酸对葡萄果实上色成熟相关基因的影响 16
4 讨论 17
致谢 18
参考文献 18
脱落酸对藤稔葡萄果实成熟调控的研究
引言
引言
葡萄生产和科学研究的重点在于葡萄品质的提高。在我国南方，葡萄果实发育和成熟期间高温多雨，光照相对不足，昼夜温差较小，时常出现果实着色不良的现象，严重影响了葡萄的品质[1]。近些年，学者研究的重点集中在葡萄生物学和生物化学等方面。2007年，葡萄基因组测序的成功为葡萄基因功能的研究奠定了基础[2]。
1.1 ABA与非呼吸跃变型果实的成熟
随着生物技术的发展，对非呼吸跃变型果实的成熟机理也有了一定的认识。越来越多的研究证明，ABA对非呼吸跃变型果实起主导作用[35]。很多果实在成熟阶段都有ABA含量高峰出现，如：柑橘[6]、鳄梨[7]、桃[8]，葡萄[9]，樱桃[10]，草莓[11]。伴随着果实成熟进程，ABA的含量是逐步增加的[10]。比如葡萄果实在始熟期前有个ABA含量高峰，ABA含量在葡萄果皮中升高了6倍，在果肉中上升8倍[12]。同时外施ABA还可以提高葡萄果实的采后品质[13]。利用ABA外施甜樱桃可以使果实提前着色，促进果实成熟[10]。近年来，基因方面的证据也表明ABA与非呼吸跃变型果实的成熟有关。在ABA的合成路径中，生化和遗传证据都表明9顺环氧类胡萝卜素双加氧酶NCED（9cisepoxycarotenoid dioxygenase ）是ABA合成的关键酶之一[14]。在樱桃果实成熟过程中，ABA参与了果实的生长发育与成熟，甜樱桃的ABA合成关键酶基因PacNCED1的表达趋势与ABA积累一致，而ABA分解代谢关键酶基因8羟化酶基因PacCYP707（8hydroxylase）的表达与ABA积累趋势相反[10]。柑橘成熟过程中积累了大量的ABA，随着柑橘果实的成熟，ABA合成关键基因CsNCED1的表达量和ABA的含量都是逐步的增加，两者表现出与果实成熟的一致性 [6]。同样在葡萄、桃中，ABA积累及其合成关键酶基因NCED的表达量变化也有类似的结果[8,10]。更为重要的是，ABA不仅可以调控果实发育、成熟和衰老的进程，而且还可以调控糖、酸和色素等物质的代谢和累积，是整个果实发育、成熟信号网络的核心组分[15]。
1.2 ABA与果实中糖等信号分子之间的关系
糖是果实风味物质、色素、氨基酸、维生素、芳香物质和其它的营养成分合成的原材料，是判断果实品质的重要指标。有研究表明，糖还是一个信号分子，可以通过复杂的糖信号转导机制调节植物中许多与生长发育相关基因的表达[16]。糖可以作为一个信号组分参与植物的生长发育，糖与乙烯、ABA、细胞分裂素和光之间的关系已有研究[17]，而且糖信号转导与一些激素信号路径间的关系已经在拟南芥中得到证实，比如糖的不敏感突变体对ABA或者乙烯会有应答[17]。
本研究的目的在于从分子生物学角度，揭示脱落酸对藤稔葡萄果实发育及成熟的调控机理，并试着研究果实发育过程中蔗糖相关基因的表达，期望为深入揭示葡萄果实发育机理，尤其是成熟机制提供依据。该研究对深入揭示果实发育信息传递的分子机制，进而也为今后葡萄的分子改良奠定重要的基础。
1 试验材料
1.1 材料及其处理
以种植于江苏省大学园艺学院江浦试验站研究基地适应性强、果粒大小均匀、糖分含量高的葡萄品种“藤稔”作为实验试材，于2014年6月初8月初分阶段采集果实。根据果实色泽、大小、硬度等指标，将果实划分为7个时期，在藤稔葡萄第一次开花时做标记，采集花后2585天的果实，每隔十天采样一次。对每个时期采取的样品设置3个重复。
在葡萄果实转色期，即花后55天，选择树势中庸，长势一致的葡萄植株，对于脱落酸（Abscisic acid）设2个浓度，分别为100μmol/L、200μmol/L；生长素（indole3acetic acid）设置2个浓度，分别为100μmol/L、200μmol/L；ABA抑制剂，去甲二氢愈创木酸(Nordihydroguaiaretic acid，NDGA)浓度100μmol/L；生长素抑制剂萘基邻氨甲酰苯甲酸（N1naphthylphtalamic acid，NPA）浓度100μmol/L。同时用等体积的清水处理一组葡萄作为对照（CK）；对于蔗糖设3个浓度，分别为3g/L、 6g/L、 12g/L，每个浓度处理5串果实。将果穗放在相应浓度溶液中浸泡大约30秒。待果实颜色有明显变化后，分别取样。取样时用干净纸巾拭去葡萄表面尘土后立即放入冰盒，带回实验室，用锋利的刀片处理果实后，液氮速冻，贮于70℃冰箱备用。用于分析果实中蔗糖、葡萄糖、果糖含量以及果实酸度等生理指标的变化。
1.2 取样
每次采样从植株的上、中、下3个部位的89个果穗上采摘大小均匀的果实，幼果期取50粒，膨大后每次采摘约30粒，放在冰盒中带回实验室。带回到实验室的样品分两部分保存，一部分用锋利无菌刀片将果皮、果肉分离，分别包入锡箔纸中，液氮速冻，贮存于70℃超低温冰箱中，用于RNA的提取；另一部分用于葡萄果实大小、单果重、干物质含量、三种可溶性糖含量、果实酸度变化趋势等的测定。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract. 1
Key words 1
引言 1
1 试验材料 2
1.1 材料及其处理 2
1.2 取样 2
2 方法 3
2.1 生理指标测定与方法 3
2.1.1 果实重量、大小及干物质含量 3
2.1.2 可溶性糖含量 3
2.1.3 果实酸度 3
2.2 果实生长及成熟过程中相关基因表达分析 3
2.2.1 葡萄果肉、果皮总RNA的提取 3
2.2.2 总RNA中DNA的消化 4
2.2.3 CDNA第一链的合成与质量检测 4
2.2.4 RTPCR 5
3 结果与分析 6
3.1 果实发育过程中生理指标的变化 6
3.1.1 果实形状、单果重及干物质含量变化 7
3.1.2 果皮与果肉中三种可溶性糖含量 8
3.1.3 果实酸度变化 10
3.2 脱落酸对果实生长发育的影响 10
3.3 脱落酸与果实着色 12
3.4 葡萄中部分成熟相关基因的表达分析 13
3.4.1 葡萄各组织总RNA提取及纯度检测 13
3.4.2 CDNA质量检测 14
3.4.3 葡萄中两种代谢相关基因的表达量分析 14
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
3.4.4 脱落酸对葡萄果实上色成熟相关基因的影响 16
4 讨论 17
致谢 18
参考文献 18
脱落酸对藤稔葡萄果实成熟调控的研究
引言
引言
葡萄生产和科学研究的重点在于葡萄品质的提高。在我国南方，葡萄果实发育和成熟期间高温多雨，光照相对不足，昼夜温差较小，时常出现果实着色不良的现象，严重影响了葡萄的品质[1]。近些年，学者研究的重点集中在葡萄生物学和生物化学等方面。2007年，葡萄基因组测序的成功为葡萄基因功能的研究奠定了基础[2]。
1.1 ABA与非呼吸跃变型果实的成熟
随着生物技术的发展，对非呼吸跃变型果实的成熟机理也有了一定的认识。越来越多的研究证明，ABA对非呼吸跃变型果实起主导作用[35]。很多果实在成熟阶段都有ABA含量高峰出现，如：柑橘[6]、鳄梨[7]、桃[8]，葡萄[9]，樱桃[10]，草莓[11]。伴随着果实成熟进程，ABA的含量是逐步增加的[10]。比如葡萄果实在始熟期前有个ABA含量高峰，ABA含量在葡萄果皮中升高了6倍，在果肉中上升8倍[12]。同时外施ABA还可以提高葡萄果实的采后品质[13]。利用ABA外施甜樱桃可以使果实提前着色，促进果实成熟[10]。近年来，基因方面的证据也表明ABA与非呼吸跃变型果实的成熟有关。在ABA的合成路径中，生化和遗传证据都表明9顺环氧类胡萝卜素双加氧酶NCED（9cisepoxycarotenoid dioxygenase ）是ABA合成的关键酶之一[14]。在樱桃果实成熟过程中，ABA参与了果实的生长发育与成熟，甜樱桃的ABA合成关键酶基因PacNCED1的表达趋势与ABA积累一致，而ABA分解代谢关键酶基因8羟化酶基因PacCYP707（8hydroxylase）的表达与ABA积累趋势相反[10]。柑橘成熟过程中积累了大量的ABA，随着柑橘果实的成熟，ABA合成关键基因CsNCED1的表达量和ABA的含量都是逐步的增加，两者表现出与果实成熟的一致性 [6]。同样在葡萄、桃中，ABA积累及其合成关键酶基因NCED的表达量变化也有类似的结果[8,10]。更为重要的是，ABA不仅可以调控果实发育、成熟和衰老的进程，而且还可以调控糖、酸和色素等物质的代谢和累积，是整个果实发育、成熟信号网络的核心组分[15]。
1.2 ABA与果实中糖等信号分子之间的关系
糖是果实风味物质、色素、氨基酸、维生素、芳香物质和其它的营养成分合成的原材料，是判断果实品质的重要指标。有研究表明，糖还是一个信号分子，可以通过复杂的糖信号转导机制调节植物中许多与生长发育相关基因的表达[16]。糖可以作为一个信号组分参与植物的生长发育，糖与乙烯、ABA、细胞分裂素和光之间的关系已有研究[17]，而且糖信号转导与一些激素信号路径间的关系已经在拟南芥中得到证实，比如糖的不敏感突变体对ABA或者乙烯会有应答[17]。
本研究的目的在于从分子生物学角度，揭示脱落酸对藤稔葡萄果实发育及成熟的调控机理，并试着研究果实发育过程中蔗糖相关基因的表达，期望为深入揭示葡萄果实发育机理，尤其是成熟机制提供依据。该研究对深入揭示果实发育信息传递的分子机制，进而也为今后葡萄的分子改良奠定重要的基础。
1 试验材料
1.1 材料及其处理
以种植于江苏省大学园艺学院江浦试验站研究基地适应性强、果粒大小均匀、糖分含量高的葡萄品种“藤稔”作为实验试材，于2014年6月初8月初分阶段采集果实。根据果实色泽、大小、硬度等指标，将果实划分为7个时期，在藤稔葡萄第一次开花时做标记，采集花后2585天的果实，每隔十天采样一次。对每个时期采取的样品设置3个重复。
在葡萄果实转色期，即花后55天，选择树势中庸，长势一致的葡萄植株，对于脱落酸（Abscisic acid）设2个浓度，分别为100μmol/L、200μmol/L；生长素（indole3acetic acid）设置2个浓度，分别为100μmol/L、200μmol/L；ABA抑制剂，去甲二氢愈创木酸(Nordihydroguaiaretic acid，NDGA)浓度100μmol/L；生长素抑制剂萘基邻氨甲酰苯甲酸（N1naphthylphtalamic acid，NPA）浓度100μmol/L。同时用等体积的清水处理一组葡萄作为对照（CK）；对于蔗糖设3个浓度，分别为3g/L、 6g/L、 12g/L，每个浓度处理5串果实。将果穗放在相应浓度溶液中浸泡大约30秒。待果实颜色有明显变化后，分别取样。取样时用干净纸巾拭去葡萄表面尘土后立即放入冰盒，带回实验室，用锋利的刀片处理果实后，液氮速冻，贮于70℃冰箱备用。用于分析果实中蔗糖、葡萄糖、果糖含量以及果实酸度等生理指标的变化。
1.2 取样
每次采样从植株的上、中、下3个部位的89个果穗上采摘大小均匀的果实，幼果期取50粒，膨大后每次采摘约30粒，放在冰盒中带回实验室。带回到实验室的样品分两部分保存，一部分用锋利无菌刀片将果皮、果肉分离，分别包入锡箔纸中，液氮速冻，贮存于70℃超低温冰箱中，用于RNA的提取；另一部分用于葡萄果实大小、单果重、干物质含量、三种可溶性糖含量、果实酸度变化趋势等的测定。
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