赤霉素诱导葡萄胚败育相关基因的克隆序列分析与时空表达特征鉴定
本实验利用赤霉素处理‘白罗莎’葡萄（Rosario Bianco）诱导其胚败育的体系，对胚败育相关的VvAGL15、VvAGL23、VvLEC1基因开展研究。通过RT-PCR克隆获得VvAGL15、VvAGL23、VvLEC1基因的编码区序列，长度分别为744bp、690bp、636bp。同源性分析表明，其与其它物种同源基因具有较高的同源性，且与拟南芥具有相同的功能结构域；启动子作用元件分析发现这三个基因均有胚乳组织特异发育相关的作用元件，推测其可能与种胚发育相关；VvAGL15、VvAGL23基因有赤霉素响应作用元件表明其可能响应赤霉素信号。qRT-PCR时空表达分析显示它们在葡萄果实发育的不同时期存在差异表达，尤其在硬核期表达水平相对较高，且赤霉素在该时期显著下调上述基因表达，多效唑则作用相反，表明赤霉素可能通过调控这三个基因的表达从而抑制胚发育。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1．1 生理形态观察材料与方法 2
1．1．1 材料与试剂 2
1．1．2 方法 2
1．2 目的基因编码区克隆材料与方法 2
1．2．1 材料 3
1．2．2 方法 3
1．3 目的基因序列分析网站及软件 6
1．3．1 材料 6
1．3．2 方法 7
1．4 目的基因时空表达分析材料与方法 7
1．4．1 实验材料与试剂 7
1．4．2 实验方法 7
2 结果与分析 8
2．1 生理形态观察与分析 8
2．1．1 果穗发育分析 8
2．1．2 不同处理果实果核区形态比较 9
2．2 VvAGL15、VvAGL23、VvLEC1基因编码区克隆和载体构建 9
2．2. 1 葡萄果实总RNA提取和cDNA的合成 9
2．2. 2 目的基因编码区克隆 10
2．2. 3 目的基因序列分析 10
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2．2. 4 目的基因载体构建 14
2．3 VvAGL15、VvAGL23、VvLEC1基因序列分析 14
2．3．1 VvAGL15、VvAGL23、VvLEC1基因与其他物种同源基因同源性分析 14
2．3．2 VvAGL15、VvAGL23、VvLEC1基因蛋白结构域分析 17
2．3．3 VvAGL15、VvAGL23、VvLEC1基因蛋白进化分析 19
2．3．4 VvAGL15、VvAGL23、VvLEC1启动子作用元件分析 20
2．4 VvAGL15、VvAGL23、VvLEC1时空表达分析 22
2．4．1 RNA提取分析 22
2．4．2 VvAGL15基因在赤霉素诱导葡萄胚败育过程中的时空表达分析 23
2．4．3 VvAGL23基因在赤霉素诱导葡萄胚败育过程中的时空表达分析 24
2．4．4 VvLEC1基因在赤霉素诱导葡萄胚败育过程中的时空表达分析 25
致谢 27
参考文献 28
赤霉素诱导葡萄胚败育相关基因的克隆、序列
分析与时空表达特征鉴定
引言
引言：葡萄（Vitis vinifera L.）是世界上种植广泛，用于鲜食、酿酒、制干和制汁，具有重要经济价值的水果。在市场上很受欢迎。‘白罗莎里奥’（Rosario Bianco）属欧亚种，2003年3月从日本引入我国，具有果实颗粒大、外观靓丽、口味纯甜爽脆、产量高、耐贮运、抗逆性强等优良性状，是一种有核品种[1]。无核是葡萄的优良性状之一，无核葡萄具有较高的商业经济价值，具有良好的市场前景，在国内和国际市场上占据重要地位，颇受广大消费者的青睐。目前，生产上培育无核葡萄有两种主要途径：一方面是直接培育或引进无核品种；另外方面是人工诱导产生无核果[2]。目前，赤霉素诱导葡萄无核化已成功应用于很多葡萄品种上，如玫瑰香、玫瑰露、里扎马特、巨峰、红地球、和田红、伊豆锦、藤稔、全球红、醉金香、魏可等[3, 4]。其中巨峰和红地球是典型的通过赤霉素诱导葡萄胚败育致无核的品种[5]。胚败育是指其经过正常的授粉受精后，合子胚在发育过程中由于某些因素的影响而终止发育。目前，赤霉素诱导葡萄胚败育的生理机制方面研究相对较多，而其分子机制方面报道颇少。因此开展对赤霉素诱导葡萄胚败育的分子机制的研究具有重要的意义。
前人研究发现，MADsBox家族基因在植物胚珠、果实发育和成熟过程中具有重要的作用[6,7]。AGL15(AGAMOUSLike 15)基因最初是从拟南芥中利用差异显著法分离得到的[8]，属于MADS 家族成员中的转录因子，通过与 DNA 结合并调控基因的表达来促进种子胚胎的发育[9]。同时 Wang等(2004)证实了在拟南芥中AGL15基因作用的一个下游基因是At GA2ox6，确定了AGL15基因参与了植物体内赤霉素调控途径。拟南芥AGL23基因调控拟南芥雌配子体(female gametophyte) 的发育并控制胚胎发育过程中细胞器的形成。在胚发育中也具有重要作用[10]。LEC家族基因对调控赤霉素和脱落酸的动态平衡来诱导和维持胚的成熟，阻止胚的萌发有重要的影响[11]。对拟南芥的研究方发现LEC家族的LEC1和LEC2转录因子对种子发育的很多方面起着重要的作用。Meinke 等(1992；1994)对拟南芥研究发现，LEC 基于三个基因座位的突变体可分为LEC1、LEC2 和 FUSCA3(FUS3)三类[12,13]。研究发现AGL15作为LEC2的靶标，可以诱导AtGA2ox6的表达，降低活性赤霉素的积累[14]，从而影响种胚发育。但是目前为止，上述基因在葡萄中研究甚少。而葡萄作为世界上重要果树，且是一种赤霉素敏感性树种[15]，具有极高的研究探索价值。基于此，本研究将以MADsBox基因和LEC基因为切入点，选择AGL15、AGL23、LEC1开展基因克隆及表达分析相关研究。通过对AGL15、AGL23、LEC1基因的生物信息学分析探讨葡萄中目的基因与其他物种的同源性；进行赤霉素诱导葡萄胚败育过程中AGL15、AGL23、LEC1时空表达分析和基因克隆对赤霉素诱导葡萄胚败育机制作出初步阐释。本研究为我们进一步认识赤霉素诱导葡萄胚败育的分子机制提供一定的理论依据，也为我们进一步利用基因手段进行无核葡萄的培育和生产提供初步理论基础。因此，本研究具有重要的理论与生产意义。
1 材料与方法
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1．1 生理形态观察材料与方法 2
1．1．1 材料与试剂 2
1．1．2 方法 2
1．2 目的基因编码区克隆材料与方法 2
1．2．1 材料 3
1．2．2 方法 3
1．3 目的基因序列分析网站及软件 6
1．3．1 材料 6
1．3．2 方法 7
1．4 目的基因时空表达分析材料与方法 7
1．4．1 实验材料与试剂 7
1．4．2 实验方法 7
2 结果与分析 8
2．1 生理形态观察与分析 8
2．1．1 果穗发育分析 8
2．1．2 不同处理果实果核区形态比较 9
2．2 VvAGL15、VvAGL23、VvLEC1基因编码区克隆和载体构建 9
2．2. 1 葡萄果实总RNA提取和cDNA的合成 9
2．2. 2 目的基因编码区克隆 10
2．2. 3 目的基因序列分析 10
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2．2. 4 目的基因载体构建 14
2．3 VvAGL15、VvAGL23、VvLEC1基因序列分析 14
2．3．1 VvAGL15、VvAGL23、VvLEC1基因与其他物种同源基因同源性分析 14
2．3．2 VvAGL15、VvAGL23、VvLEC1基因蛋白结构域分析 17
2．3．3 VvAGL15、VvAGL23、VvLEC1基因蛋白进化分析 19
2．3．4 VvAGL15、VvAGL23、VvLEC1启动子作用元件分析 20
2．4 VvAGL15、VvAGL23、VvLEC1时空表达分析 22
2．4．1 RNA提取分析 22
2．4．2 VvAGL15基因在赤霉素诱导葡萄胚败育过程中的时空表达分析 23
2．4．3 VvAGL23基因在赤霉素诱导葡萄胚败育过程中的时空表达分析 24
2．4．4 VvLEC1基因在赤霉素诱导葡萄胚败育过程中的时空表达分析 25
致谢 27
参考文献 28
赤霉素诱导葡萄胚败育相关基因的克隆、序列
分析与时空表达特征鉴定
引言
引言：葡萄（Vitis vinifera L.）是世界上种植广泛，用于鲜食、酿酒、制干和制汁，具有重要经济价值的水果。在市场上很受欢迎。‘白罗莎里奥’（Rosario Bianco）属欧亚种，2003年3月从日本引入我国，具有果实颗粒大、外观靓丽、口味纯甜爽脆、产量高、耐贮运、抗逆性强等优良性状，是一种有核品种[1]。无核是葡萄的优良性状之一，无核葡萄具有较高的商业经济价值，具有良好的市场前景，在国内和国际市场上占据重要地位，颇受广大消费者的青睐。目前，生产上培育无核葡萄有两种主要途径：一方面是直接培育或引进无核品种；另外方面是人工诱导产生无核果[2]。目前，赤霉素诱导葡萄无核化已成功应用于很多葡萄品种上，如玫瑰香、玫瑰露、里扎马特、巨峰、红地球、和田红、伊豆锦、藤稔、全球红、醉金香、魏可等[3, 4]。其中巨峰和红地球是典型的通过赤霉素诱导葡萄胚败育致无核的品种[5]。胚败育是指其经过正常的授粉受精后，合子胚在发育过程中由于某些因素的影响而终止发育。目前，赤霉素诱导葡萄胚败育的生理机制方面研究相对较多，而其分子机制方面报道颇少。因此开展对赤霉素诱导葡萄胚败育的分子机制的研究具有重要的意义。
前人研究发现，MADsBox家族基因在植物胚珠、果实发育和成熟过程中具有重要的作用[6,7]。AGL15(AGAMOUSLike 15)基因最初是从拟南芥中利用差异显著法分离得到的[8]，属于MADS 家族成员中的转录因子，通过与 DNA 结合并调控基因的表达来促进种子胚胎的发育[9]。同时 Wang等(2004)证实了在拟南芥中AGL15基因作用的一个下游基因是At GA2ox6，确定了AGL15基因参与了植物体内赤霉素调控途径。拟南芥AGL23基因调控拟南芥雌配子体(female gametophyte) 的发育并控制胚胎发育过程中细胞器的形成。在胚发育中也具有重要作用[10]。LEC家族基因对调控赤霉素和脱落酸的动态平衡来诱导和维持胚的成熟，阻止胚的萌发有重要的影响[11]。对拟南芥的研究方发现LEC家族的LEC1和LEC2转录因子对种子发育的很多方面起着重要的作用。Meinke 等(1992；1994)对拟南芥研究发现，LEC 基于三个基因座位的突变体可分为LEC1、LEC2 和 FUSCA3(FUS3)三类[12,13]。研究发现AGL15作为LEC2的靶标，可以诱导AtGA2ox6的表达，降低活性赤霉素的积累[14]，从而影响种胚发育。但是目前为止，上述基因在葡萄中研究甚少。而葡萄作为世界上重要果树，且是一种赤霉素敏感性树种[15]，具有极高的研究探索价值。基于此，本研究将以MADsBox基因和LEC基因为切入点，选择AGL15、AGL23、LEC1开展基因克隆及表达分析相关研究。通过对AGL15、AGL23、LEC1基因的生物信息学分析探讨葡萄中目的基因与其他物种的同源性；进行赤霉素诱导葡萄胚败育过程中AGL15、AGL23、LEC1时空表达分析和基因克隆对赤霉素诱导葡萄胚败育机制作出初步阐释。本研究为我们进一步认识赤霉素诱导葡萄胚败育的分子机制提供一定的理论依据，也为我们进一步利用基因手段进行无核葡萄的培育和生产提供初步理论基础。因此，本研究具有重要的理论与生产意义。
1 材料与方法
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