草莓灰霉病的菌种提取及侵染机理
目 录
1 引言 1
1.1 草莓灰霉病 1
1.2 病菌形态 1
1.3 危害症状 1
1.4 传播方式及侵染方式 1
1.5 气候对草莓苗灰霉病发病的影响 2
1.6 本实验研究的目的及意义 2
2 材料和方法 2
2.1 试验材料 2
2.2 试验仪器 2
2.3 试验方法 2
2.4 发病率测定及生理指标测定与方法 4
3 结果与分析 5
3.1 菌种纯化过程 5
3.2 纯化后所得的菌种以及侵染后发病的植株 5
3.3 不同温度对草莓发病率的影响 6
3.4 不同湿度对草莓发病率的影响 6
3.5 光照处理和黑暗处理对草莓发病率的影响 7
3.6 灰霉病对草莓植株叶绿素的影响 7
3.7 灰霉病对草莓植株电导率的影响 9
3.8 灰霉病对草莓植株丙二醛的影响 10
4 讨论 12
4.1 不同提取方法对菌种纯化的影响 12
4.2 温度对草莓灰霉病发病规律的影响 12
4.3 湿度和光照对草莓灰霉病发病规律的影响 13
4.4 感染灰霉病的草莓苗对生理指标所产生的影响 13
结论 14
致 谢 15
参考文献 16
1 引言
1.1 草莓灰霉病
草莓在生长过当程中常受到多因素的干扰，其中草莓灰霉病是影响草莓产量的重要因素之一，而该病害是由灰葡萄孢菌引起的真菌性病害。 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
主要侵染果实，也侵染叶片、叶柄、花瓣、花萼及果梗等，引起腐烂；遇到潮湿天气叶片表面密生灰色霉状物，天气干燥也易干腐[1]，也是储存过程中的主要病害，严重影响了草莓的产量和品质。
1.2 病菌形态
草莓灰霉病是受灰葡萄孢菌浸染的一种病害，属半知菌亚门[2]。葡萄孢属的真菌病菌寄生性强，寄主范围广，主要以分生孢子，菌丝体，菌核3种形态存在于病残体和土壤中[3]。分生孢子多簇生于分生孢子梗的顶端，也可单生，单孢近圆形或椭圆形，大小11-15nm [4]。
1.3 危害症状
草莓灰霉病在叶片、叶柄上发病时，形状不规则[5]，典型症状是在叶缘处形成小“V”字形病斑，并逐步向叶片深处扩展，病斑范围增大[6-7]。有的具有轮纹或是产生褐色病斑。当草莓苗处于较潮湿的条件下时，在叶背处可观察到乳白色绒毛状菌丝团[8]；花器发病时，会呈现黄褐色，导致花序干枯败死；果实发病时，初期先是侵染幼果，形成水渍状小斑点至褐色病斑，染病后期随着病菌的侵人加上外界条件的改变，病斑逐渐扩散到整个果面，使果实呈灰白色并且变软、变腐，生成灰色霉状物或者干腐脱落[9-11]，从而失去了果实原有的形、色、香、味。生长期的果实感病后，在采收后会陆续不断的腐烂。而导致草莓苗发生灰霉病的因素不止湿度问题，还包括温度、光照、风、品种、施肥状况、栽植密度和管理措施等的影响。
1.4 传播方式及侵染方式
灰葡萄孢菌靠空气携带传播，主要是分生孢子随气流、浇灌水和农具等传播。灰葡萄孢菌常在植物发育初期阶段侵入宿主，并在相当长一段时期内保持沉默，直到宿主植物生理发生转变有利于其生长时，该病原菌便迅速引发宿主软腐，引起成熟或衰老组织的严重破坏。灰葡萄孢菌的侵染过程一般可分为以下几个阶段：穿透宿主表皮，杀死宿主组织，组织腐烂和孢子形成[11]。
1.5 气候对草莓苗灰霉病发病的影响
草莓种植户对温度及湿度把握好差也是导致该病发病的重要因素。该病的病原菌在湿度，温度适宜的条件下会大量繁殖。据调查，淮安草莓大棚栽培12月份是草莓灰霉病的高发季节。适宜的温度可促进病菌的形成及蔓延。特别是阴雨天气，气温相对偏低，日照时间较少，促进孢子不断产生，形成反复侵染致使灰霉病成灾难性爆发。
1.6 本研究的目的和意义
目前，草莓基本上没有很好的抗灰霉病的种质资源，且灰霉病的防治主要依靠化学方法。但由于化学污染以及灰霉病高抗药性的问题，并且草莓属于鲜食水果，对化学防治更是严格控制。为了减少农药的使用，本试验是从已发病的草莓果实中分离灰霉病菌种进行纯化，然后将纯化的菌种接种到健康的草莓苗上，通过人工控制温度、湿度、光照三个条件来研究其发病规律及侵染机理，并测出电导率、丙二醛、叶绿素等指标，从而能够找出灰霉病病菌生长、侵染及抑制其生长、侵染的最适温度。为草莓灰霉病的生态防治提供一定的理论依据。
2 材料和方法
2.1 试验材料
草莓病果、马铃薯、葡萄糖、琼脂粉、牛肉膏、蛋白胨、草莓苗“章姬”、乙醇、石英砂、碳酸钙粉、三氯乙酸（TCA）、硫代巴比妥酸、无菌水等。
2.2 试验仪器
水浴锅、高温高压灭菌锅、恒温恒湿培养箱、无菌操作台、离心机、电导仪、接种环、光学显微镜、培养皿、接种针，接种环，涂布棒、电子秤、电炉、分 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
光光度计等。
2.3 试验方法
2.3.1 培养基的制作
灰霉病的菌种分离及纯化采用两种制作方法：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基和PSA培养基。牛肉膏蛋白胨琼脂培养基配制方法：按照牛肉浸膏3g、蛋白胨5g、琼脂粉10g、蒸馏水1000ml的比例配制。将牛肉膏、蛋白胨溶解在热水中，加入琼脂粉煮沸，调节PH值为7.2，并将其装入三角瓶中并盖上棉塞，然后放入灭菌锅中灭菌（121℃高压蒸汽灭菌15min）。
PSA培养基制作方法：按马铃薯200g，琼脂粉20g，蔗糖20g，蒸馏水1000ml的比例进行配比。具体方法如下：
1）将马铃薯洗净后去皮，称取所需的量，切成小块，加1000毫升水煮沸半小时左右，用漏斗加2层纱布垫着，再用8层纱布过滤，将滤液失去的水补足到1000毫升。
2）将琼脂粉加到马铃薯汁中加热使之完全融化，再加入糖，使其溶化。
3）并分装入250mL三角瓶中，每个三角瓶装溶液1/2,然后加上棉塞封着管口。
4）将制作好的培养基、培养瓶、培养皿、涂布棒、50mL容量瓶、试管等进行灭菌（121℃高压蒸汽灭菌15min）。
2.3.2 菌种的分离
将发病的果实表面用无菌水冲洗3次，用接种环接触霉层并在PSA培养基上进行平板划线法培养，在28℃的培养箱中倒置培养2~5天。
2.3.3 菌种的纯化
将之前培养出来的菌种通过观察找出灰霉病菌落并用接种针挑出配制成原液，再将原液进行稀释，稀释成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的各种稀释度的灰霉病菌的溶液。取10-2、10-3、10-4、10-5、10-6五组浓度的灰霉菌溶液，通过平板划线法、连续涂布法进行培养纯化。
纯化的方法采用平板划线法和涂布法，并用牛肉膏蛋白胨培养基和PSA培养基同时进行纯化培养，观察哪种方法更适合纯化。
平板划线法：
1）按无菌操作，用接种环取灰霉病菌稀释液10-2一环，先在平板培养基的一边作第一次平行划线3或4次。
1 引言 1
1.1 草莓灰霉病 1
1.2 病菌形态 1
1.3 危害症状 1
1.4 传播方式及侵染方式 1
1.5 气候对草莓苗灰霉病发病的影响 2
1.6 本实验研究的目的及意义 2
2 材料和方法 2
2.1 试验材料 2
2.2 试验仪器 2
2.3 试验方法 2
2.4 发病率测定及生理指标测定与方法 4
3 结果与分析 5
3.1 菌种纯化过程 5
3.2 纯化后所得的菌种以及侵染后发病的植株 5
3.3 不同温度对草莓发病率的影响 6
3.4 不同湿度对草莓发病率的影响 6
3.5 光照处理和黑暗处理对草莓发病率的影响 7
3.6 灰霉病对草莓植株叶绿素的影响 7
3.7 灰霉病对草莓植株电导率的影响 9
3.8 灰霉病对草莓植株丙二醛的影响 10
4 讨论 12
4.1 不同提取方法对菌种纯化的影响 12
4.2 温度对草莓灰霉病发病规律的影响 12
4.3 湿度和光照对草莓灰霉病发病规律的影响 13
4.4 感染灰霉病的草莓苗对生理指标所产生的影响 13
结论 14
致 谢 15
参考文献 16
1 引言
1.1 草莓灰霉病
草莓在生长过当程中常受到多因素的干扰，其中草莓灰霉病是影响草莓产量的重要因素之一，而该病害是由灰葡萄孢菌引起的真菌性病害。 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
主要侵染果实，也侵染叶片、叶柄、花瓣、花萼及果梗等，引起腐烂；遇到潮湿天气叶片表面密生灰色霉状物，天气干燥也易干腐[1]，也是储存过程中的主要病害，严重影响了草莓的产量和品质。
1.2 病菌形态
草莓灰霉病是受灰葡萄孢菌浸染的一种病害，属半知菌亚门[2]。葡萄孢属的真菌病菌寄生性强，寄主范围广，主要以分生孢子，菌丝体，菌核3种形态存在于病残体和土壤中[3]。分生孢子多簇生于分生孢子梗的顶端，也可单生，单孢近圆形或椭圆形，大小11-15nm [4]。
1.3 危害症状
草莓灰霉病在叶片、叶柄上发病时，形状不规则[5]，典型症状是在叶缘处形成小“V”字形病斑，并逐步向叶片深处扩展，病斑范围增大[6-7]。有的具有轮纹或是产生褐色病斑。当草莓苗处于较潮湿的条件下时，在叶背处可观察到乳白色绒毛状菌丝团[8]；花器发病时，会呈现黄褐色，导致花序干枯败死；果实发病时，初期先是侵染幼果，形成水渍状小斑点至褐色病斑，染病后期随着病菌的侵人加上外界条件的改变，病斑逐渐扩散到整个果面，使果实呈灰白色并且变软、变腐，生成灰色霉状物或者干腐脱落[9-11]，从而失去了果实原有的形、色、香、味。生长期的果实感病后，在采收后会陆续不断的腐烂。而导致草莓苗发生灰霉病的因素不止湿度问题，还包括温度、光照、风、品种、施肥状况、栽植密度和管理措施等的影响。
1.4 传播方式及侵染方式
灰葡萄孢菌靠空气携带传播，主要是分生孢子随气流、浇灌水和农具等传播。灰葡萄孢菌常在植物发育初期阶段侵入宿主，并在相当长一段时期内保持沉默，直到宿主植物生理发生转变有利于其生长时，该病原菌便迅速引发宿主软腐，引起成熟或衰老组织的严重破坏。灰葡萄孢菌的侵染过程一般可分为以下几个阶段：穿透宿主表皮，杀死宿主组织，组织腐烂和孢子形成[11]。
1.5 气候对草莓苗灰霉病发病的影响
草莓种植户对温度及湿度把握好差也是导致该病发病的重要因素。该病的病原菌在湿度，温度适宜的条件下会大量繁殖。据调查，淮安草莓大棚栽培12月份是草莓灰霉病的高发季节。适宜的温度可促进病菌的形成及蔓延。特别是阴雨天气，气温相对偏低，日照时间较少，促进孢子不断产生，形成反复侵染致使灰霉病成灾难性爆发。
1.6 本研究的目的和意义
目前，草莓基本上没有很好的抗灰霉病的种质资源，且灰霉病的防治主要依靠化学方法。但由于化学污染以及灰霉病高抗药性的问题，并且草莓属于鲜食水果，对化学防治更是严格控制。为了减少农药的使用，本试验是从已发病的草莓果实中分离灰霉病菌种进行纯化，然后将纯化的菌种接种到健康的草莓苗上，通过人工控制温度、湿度、光照三个条件来研究其发病规律及侵染机理，并测出电导率、丙二醛、叶绿素等指标，从而能够找出灰霉病病菌生长、侵染及抑制其生长、侵染的最适温度。为草莓灰霉病的生态防治提供一定的理论依据。
2 材料和方法
2.1 试验材料
草莓病果、马铃薯、葡萄糖、琼脂粉、牛肉膏、蛋白胨、草莓苗“章姬”、乙醇、石英砂、碳酸钙粉、三氯乙酸（TCA）、硫代巴比妥酸、无菌水等。
2.2 试验仪器
水浴锅、高温高压灭菌锅、恒温恒湿培养箱、无菌操作台、离心机、电导仪、接种环、光学显微镜、培养皿、接种针，接种环，涂布棒、电子秤、电炉、分 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
光光度计等。
2.3 试验方法
2.3.1 培养基的制作
灰霉病的菌种分离及纯化采用两种制作方法：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基和PSA培养基。牛肉膏蛋白胨琼脂培养基配制方法：按照牛肉浸膏3g、蛋白胨5g、琼脂粉10g、蒸馏水1000ml的比例配制。将牛肉膏、蛋白胨溶解在热水中，加入琼脂粉煮沸，调节PH值为7.2，并将其装入三角瓶中并盖上棉塞，然后放入灭菌锅中灭菌（121℃高压蒸汽灭菌15min）。
PSA培养基制作方法：按马铃薯200g，琼脂粉20g，蔗糖20g，蒸馏水1000ml的比例进行配比。具体方法如下：
1）将马铃薯洗净后去皮，称取所需的量，切成小块，加1000毫升水煮沸半小时左右，用漏斗加2层纱布垫着，再用8层纱布过滤，将滤液失去的水补足到1000毫升。
2）将琼脂粉加到马铃薯汁中加热使之完全融化，再加入糖，使其溶化。
3）并分装入250mL三角瓶中，每个三角瓶装溶液1/2,然后加上棉塞封着管口。
4）将制作好的培养基、培养瓶、培养皿、涂布棒、50mL容量瓶、试管等进行灭菌（121℃高压蒸汽灭菌15min）。
2.3.2 菌种的分离
将发病的果实表面用无菌水冲洗3次，用接种环接触霉层并在PSA培养基上进行平板划线法培养，在28℃的培养箱中倒置培养2~5天。
2.3.3 菌种的纯化
将之前培养出来的菌种通过观察找出灰霉病菌落并用接种针挑出配制成原液，再将原液进行稀释，稀释成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的各种稀释度的灰霉病菌的溶液。取10-2、10-3、10-4、10-5、10-6五组浓度的灰霉菌溶液，通过平板划线法、连续涂布法进行培养纯化。
纯化的方法采用平板划线法和涂布法，并用牛肉膏蛋白胨培养基和PSA培养基同时进行纯化培养，观察哪种方法更适合纯化。
平板划线法：
1）按无菌操作，用接种环取灰霉病菌稀释液10-2一环，先在平板培养基的一边作第一次平行划线3或4次。
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