白藜芦醇在葡萄果实不同部位含量及提取工艺的研究
目 录
1 引言 1
1.1 白藜芦醇的研究概况 1
1.2 葡萄中白藜芦醇提取方法的研究 1
1.3 葡萄中白藜芦醇含量测定方法的研究 3
1.4 本试验研究的目的及意义 3
2 材料与方法 4
2.1 试验材料及器材 4
2.2 试验方法 4
2.3 指标测定与方法 6
2.4 数据分析 6
3 结果与分析 7
3.1 乙醇浓度对提取量的影响曲线 7
3.2 水浴时间对提取量的影响曲线 7
3.3 水浴温度对提取量的影响曲线 8
3.4 超声时间对提取量的影响曲线 8
3.5 料液比对提取量的影响曲线 9
3.6 最佳工艺条件下提取葡萄果实不同部位的白藜芦醇 9
4 讨论 10
结论 11
致谢 12
参考文献 13
1 引言
1.1 白藜芦醇的研究概况
1939年化学家高冈[1]从植物白藜芦的根莲中提取得到白藜芦醇，这是最早的研究发现。1976年有[2]研究发现白藜芦醇是一种植物保护素。白藜芦醇是一些植物受到应激时本身能合成的一种抗毒素[3]，是多酚类化合物中的一种，其分子结构如图1。白藜芦醇有3个重要的药理作用：抗癌、抗氧化、心血管保护，除此以外还具有雌激素调节[4]、抗菌消炎[5]、抗突变[6]、转基因[7]、防辐射[8]等多方面药理作用。白藜芦醇主要存在于葡萄、虎杖等植物中。
白藜芦醇的提取方法有：有机溶剂振荡提取法、碱提法、超临界流体萃取法、超声辅助提取法、微波辅助提取法、酶解辅助提取法。白藜芦醇 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
的含量测定方法有：高效液相色谱法、紫外分光光度法、溴量法和分子荧光法。
图1 白藜芦醇的分子结构
1.2 提取方法研究概况
1.2.1 有机溶剂振荡提取法
白藜芦醇这种多酚类化合物易溶解于极性强的溶剂中，提取溶剂[9]通常用无水乙醇和甲醇，萃取分离的试剂通常用石油醚、乙酸乙酯或氯仿[10]。
孟宪军[11]等用有机溶剂法提取野生山葡萄中白藜芦醇时，得出最佳工艺是用乙酸乙酯作为溶剂，浸提2次、料液比为l：40、提取温度为60℃、提取时间为40min。用这种方法提取白藜芦醇提取率比用普通溶剂法提取略高，但多种有机溶剂使得产品和操作存在着一定的安全隐患，因此不适宜工业大量生产。
1.2.2 碱溶液提取法
碱提法提取白藜芦醇是基于白藜芦醇在特定条件下能与某些碱性盐形成酚盐而从体系里溶解出来的特性,通过调节溶液pH值的方法使之沉淀，从而提取出白藜芦醇。碱提取法与有机溶液提取法相比的优点有工艺简单、操作方便、溶剂使用量少、选择性强、提取率高。但通常情况下碱提取法多用于黄酮类化合物的提取。
1.2.3 超临界流体萃取法
超临界流体是指向处于临界温度和临界压力以上状态的气体加压，只会密度增大但不会液化的气体。CO2作为常用的超临界流体，其优点有：没有毒副作用、不易燃烧、性质稳定。用这种方法提取分离主要是利用超临界CO2的高渗透性和高溶解能力。井山林等[12]报道：运用这种方法提取萃取物中白藜芦醇的含量较高。因此，这种方法适用于富集和提取白藜芦醇。
1.2.4 超声辅助提取法
超声提取法广泛应用于植物中有效成分的提取[13]。其原理是利用超声振动能量能改变物质组织结构、功能、状态 [14]，这种方法也同样适用于白藜芦醇的提取。运用超声辅助技术被浸泡的化学成分的性质和结构不会发生任何改变[15]，是因为超声波破碎过程是一种物理过程，而且应用这种技术还能有效提高提取率。
江曙等[16]实验表明：超声辅助提取法用75%的乙醇提取效果比超临界CO2萃取和回流提取的效果都好。超声提取法能维持有效成分的性质而且效率高，但是这种方法只局限于实验室中操作，不适用于工业生产上大容积提取罐，会因为超声波衰减易形成超声空白区，因此不适用于大规模的生产。
1.2.5 微波辅助提取法
微波辅助萃取法是分析化学中制备、分析样品的一种有效方法。这种方法的原理是：微波能使原料中的化学成分快速溶出[17]。这种方法的特点是：设备简单，减少溶剂的消耗，降低生产时间，使用的范围广，虽然提取率不是很高，但适用于工业化生产。它的优越性更在于这一技术更加环保，是一种全新的“绿色”萃取技术[18]。
1.2.6 酶解辅助提取法
用酶解法提取葡萄中的白藜芦醇：把葡萄皮渣研磨成粉末，适当加入酶溶剂进行酶解，用乙酸乙酯进行升温浸提，减压抽滤，滤液浓缩后用硅胶柱层析分离纯化，得出白藜芦醇浓度。
利用酶解辅助提取法提取能提高葡萄中白藜芦醇的含量，而且酶法提取所得产品没有毒副作用，安全性高。常用来提取白藜芦醇的酶，目前研究比较多的通常是用纤维素酶提取。但是细胞壁成分一般都很复杂，酶用量比较多，酶解效率比较低，并且酶的价格比较贵，不适用于工业化生产。目 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
前研究的一大热点是酶的固定化技术及利用生物方法培育高产酶的菌株，此外为了提高酶解效率还能采用物理方法进行辅助酶解[19]。
1.3 含量测定方法的研究
1.3.1 高效液相色谱法（HPLC）
唐迪等[20]采用高效液相色谱法测定葡萄皮渣中的白藜芦醇，白藜芦醇的平均回收率高达98.9%，RSD是5.04%。有研究报道[21]在质谱检测、荧光检测、紫外检测和HPLC检测法中，荧光检测和质谱检测的灵敏度比较高，但HPLC的灵敏度最高，除此以外其优点还有：容易回收、用量少、柱子可以反复利用。只是液相色谱仪的价格昂贵，对生物大分子和无机离子分析较难，不能得到物质的结构信息，流动相消耗的多且大多有毒。
1.3.2 紫外分光光度法
紫外分光光度法一般用于芳香族化合物的定量测定，目前这种方法被广泛应用于有机化合物的微量分析之中。是利用物质对光具有选择性吸收这一特点。用这种方法进行有机官能团的定量分析，其优点是：灵敏、快速、分析混合物时在某些情况下各组成成分不需要事先分离等。
1.3.3 溴量法
含1个活泼双键和3个酚羟基的白藜芦醇能与溴分子发生亲电取代和亲电加成反应，只要能确定与一分子白藜芦醇起反应的溴分子数，就能确定白藜芦醇的含量。此法的优点有操作简单、测定准确，适用于葡萄、决明、虎杖等天然产物中白藜芦醇的测定。
1.3.4 分子荧光法
白藜芦醇为荧光活性物质，分子中含苯环共轭体系和双键，共轭基团能增加荧光效率。利用分子荧光法定量时，在一定条件下荧光强度与物质浓度成正比，基于这一特性能测定出白藜芦醇的含量。有研究表明, 此方法操作简便、灵敏、快速，在食品开发中具有一定的应用价值，为白藜芦醇的实验研究提供了科学依据。
1.4 本试验研究的目的及意义
葡萄原产于欧洲、西亚和北非一带，在中国各地都有栽培。中国古代医书记载葡萄各个组织均可入药[22] ，所以是药食同源植物。国内外研究发现，葡萄中的白藜芦醇及其衍生物与其药理作用密切相关。这类化合物在葡萄的果实、根、茎、叶中都含有。古往今来，人们对葡萄的应用领域研究概括起来可分成工业用、农业用、食用和药用。葡萄中约80%用于酿酒[23]。
1 引言 1
1.1 白藜芦醇的研究概况 1
1.2 葡萄中白藜芦醇提取方法的研究 1
1.3 葡萄中白藜芦醇含量测定方法的研究 3
1.4 本试验研究的目的及意义 3
2 材料与方法 4
2.1 试验材料及器材 4
2.2 试验方法 4
2.3 指标测定与方法 6
2.4 数据分析 6
3 结果与分析 7
3.1 乙醇浓度对提取量的影响曲线 7
3.2 水浴时间对提取量的影响曲线 7
3.3 水浴温度对提取量的影响曲线 8
3.4 超声时间对提取量的影响曲线 8
3.5 料液比对提取量的影响曲线 9
3.6 最佳工艺条件下提取葡萄果实不同部位的白藜芦醇 9
4 讨论 10
结论 11
致谢 12
参考文献 13
1 引言
1.1 白藜芦醇的研究概况
1939年化学家高冈[1]从植物白藜芦的根莲中提取得到白藜芦醇，这是最早的研究发现。1976年有[2]研究发现白藜芦醇是一种植物保护素。白藜芦醇是一些植物受到应激时本身能合成的一种抗毒素[3]，是多酚类化合物中的一种，其分子结构如图1。白藜芦醇有3个重要的药理作用：抗癌、抗氧化、心血管保护，除此以外还具有雌激素调节[4]、抗菌消炎[5]、抗突变[6]、转基因[7]、防辐射[8]等多方面药理作用。白藜芦醇主要存在于葡萄、虎杖等植物中。
白藜芦醇的提取方法有：有机溶剂振荡提取法、碱提法、超临界流体萃取法、超声辅助提取法、微波辅助提取法、酶解辅助提取法。白藜芦醇 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
的含量测定方法有：高效液相色谱法、紫外分光光度法、溴量法和分子荧光法。
图1 白藜芦醇的分子结构
1.2 提取方法研究概况
1.2.1 有机溶剂振荡提取法
白藜芦醇这种多酚类化合物易溶解于极性强的溶剂中，提取溶剂[9]通常用无水乙醇和甲醇，萃取分离的试剂通常用石油醚、乙酸乙酯或氯仿[10]。
孟宪军[11]等用有机溶剂法提取野生山葡萄中白藜芦醇时，得出最佳工艺是用乙酸乙酯作为溶剂，浸提2次、料液比为l：40、提取温度为60℃、提取时间为40min。用这种方法提取白藜芦醇提取率比用普通溶剂法提取略高，但多种有机溶剂使得产品和操作存在着一定的安全隐患，因此不适宜工业大量生产。
1.2.2 碱溶液提取法
碱提法提取白藜芦醇是基于白藜芦醇在特定条件下能与某些碱性盐形成酚盐而从体系里溶解出来的特性,通过调节溶液pH值的方法使之沉淀，从而提取出白藜芦醇。碱提取法与有机溶液提取法相比的优点有工艺简单、操作方便、溶剂使用量少、选择性强、提取率高。但通常情况下碱提取法多用于黄酮类化合物的提取。
1.2.3 超临界流体萃取法
超临界流体是指向处于临界温度和临界压力以上状态的气体加压，只会密度增大但不会液化的气体。CO2作为常用的超临界流体，其优点有：没有毒副作用、不易燃烧、性质稳定。用这种方法提取分离主要是利用超临界CO2的高渗透性和高溶解能力。井山林等[12]报道：运用这种方法提取萃取物中白藜芦醇的含量较高。因此，这种方法适用于富集和提取白藜芦醇。
1.2.4 超声辅助提取法
超声提取法广泛应用于植物中有效成分的提取[13]。其原理是利用超声振动能量能改变物质组织结构、功能、状态 [14]，这种方法也同样适用于白藜芦醇的提取。运用超声辅助技术被浸泡的化学成分的性质和结构不会发生任何改变[15]，是因为超声波破碎过程是一种物理过程，而且应用这种技术还能有效提高提取率。
江曙等[16]实验表明：超声辅助提取法用75%的乙醇提取效果比超临界CO2萃取和回流提取的效果都好。超声提取法能维持有效成分的性质而且效率高，但是这种方法只局限于实验室中操作，不适用于工业生产上大容积提取罐，会因为超声波衰减易形成超声空白区，因此不适用于大规模的生产。
1.2.5 微波辅助提取法
微波辅助萃取法是分析化学中制备、分析样品的一种有效方法。这种方法的原理是：微波能使原料中的化学成分快速溶出[17]。这种方法的特点是：设备简单，减少溶剂的消耗，降低生产时间，使用的范围广，虽然提取率不是很高，但适用于工业化生产。它的优越性更在于这一技术更加环保，是一种全新的“绿色”萃取技术[18]。
1.2.6 酶解辅助提取法
用酶解法提取葡萄中的白藜芦醇：把葡萄皮渣研磨成粉末，适当加入酶溶剂进行酶解，用乙酸乙酯进行升温浸提，减压抽滤，滤液浓缩后用硅胶柱层析分离纯化，得出白藜芦醇浓度。
利用酶解辅助提取法提取能提高葡萄中白藜芦醇的含量，而且酶法提取所得产品没有毒副作用，安全性高。常用来提取白藜芦醇的酶，目前研究比较多的通常是用纤维素酶提取。但是细胞壁成分一般都很复杂，酶用量比较多，酶解效率比较低，并且酶的价格比较贵，不适用于工业化生产。目 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
前研究的一大热点是酶的固定化技术及利用生物方法培育高产酶的菌株，此外为了提高酶解效率还能采用物理方法进行辅助酶解[19]。
1.3 含量测定方法的研究
1.3.1 高效液相色谱法（HPLC）
唐迪等[20]采用高效液相色谱法测定葡萄皮渣中的白藜芦醇，白藜芦醇的平均回收率高达98.9%，RSD是5.04%。有研究报道[21]在质谱检测、荧光检测、紫外检测和HPLC检测法中，荧光检测和质谱检测的灵敏度比较高，但HPLC的灵敏度最高，除此以外其优点还有：容易回收、用量少、柱子可以反复利用。只是液相色谱仪的价格昂贵，对生物大分子和无机离子分析较难，不能得到物质的结构信息，流动相消耗的多且大多有毒。
1.3.2 紫外分光光度法
紫外分光光度法一般用于芳香族化合物的定量测定，目前这种方法被广泛应用于有机化合物的微量分析之中。是利用物质对光具有选择性吸收这一特点。用这种方法进行有机官能团的定量分析，其优点是：灵敏、快速、分析混合物时在某些情况下各组成成分不需要事先分离等。
1.3.3 溴量法
含1个活泼双键和3个酚羟基的白藜芦醇能与溴分子发生亲电取代和亲电加成反应，只要能确定与一分子白藜芦醇起反应的溴分子数，就能确定白藜芦醇的含量。此法的优点有操作简单、测定准确，适用于葡萄、决明、虎杖等天然产物中白藜芦醇的测定。
1.3.4 分子荧光法
白藜芦醇为荧光活性物质，分子中含苯环共轭体系和双键，共轭基团能增加荧光效率。利用分子荧光法定量时，在一定条件下荧光强度与物质浓度成正比，基于这一特性能测定出白藜芦醇的含量。有研究表明, 此方法操作简便、灵敏、快速，在食品开发中具有一定的应用价值，为白藜芦醇的实验研究提供了科学依据。
1.4 本试验研究的目的及意义
葡萄原产于欧洲、西亚和北非一带，在中国各地都有栽培。中国古代医书记载葡萄各个组织均可入药[22] ，所以是药食同源植物。国内外研究发现，葡萄中的白藜芦醇及其衍生物与其药理作用密切相关。这类化合物在葡萄的果实、根、茎、叶中都含有。古往今来，人们对葡萄的应用领域研究概括起来可分成工业用、农业用、食用和药用。葡萄中约80%用于酿酒[23]。
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