青花菜游离小孢子培养及其体系优化
摘要：游离小孢子培养已经成为青花菜现代育种重要的手段之一。它可以缩短育种年限，加快育种进程，降低误选，加快种质资源的创新，游离小孢子培养已逐渐成为青花菜育种的研究热点。本实验以10 份不同类型的青花菜为试材，研究了基因型、小孢子发育时期、培养基类型及pH 值等因素对青花菜游离小孢子培养影响。结果表明:基因型是影响青花菜小孢子培养胚状体发生的关键因子,处于单核靠边期的小孢子是诱导小孢子胚状体发生的最佳时期，1/2 NLN + 130 g蔗糖是青花菜小孢子培养的最佳培养基,在1/2的NLN培养基中添加适量的活性炭有利于胚胎发生。4℃预处理24小时和33℃热激24小时有利于小孢子胚胎发生。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 试验材料与方法 2
1.1 供体植株及其生长条件 2
1.2 试验用具及试剂 2
1.2.1 用具 2
1.2.2 试剂 2
1.3 试验方法 2
1.3.1 取样 2
1.3.2 小孢子发育时期的细胞学观察 2
1.3.3 镜检 2
1.3.4 小孢子的游离和培养 2
1.3.5植株再生与移植 3
1.4 影响游离小孢子培养胚胎发生因素的研究 3
1.4.1 基因型 3
1.4.2 活性碳浓度 3
1.4.3 温度胁迫处理 3
1.4.4 数据统计与分析 3
2 结果与分析 3
2.1 小孢子发育时期与花蕾长度的关系 3
2.2 基因型对游离小孢子培养胚胎发生的影响 4
2.3 活性炭浓度对小孢子培养胚胎发生的影响 5
2.4 温度胁迫处理对小孢子培养胚胎发生的影响 5
3 讨论 6
参考文献: 7
青花菜游离小孢子培养及其体系优化
引言
引言：青花菜(Brassica oleracea var. italica)起源于欧洲
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
地中海沿岸,属于十字花科芸薹属[1]。青花菜是一种主要的蔬菜，其营养成分高，还含有吲哚甲醇、B胡萝卜素等物质，是营养保健蔬菜，在国内外都大量种植．我国内地青花菜品种育种的研究起步较晚，育成的优良品种有限，生产上种植的大多数品种从我国台湾或国外引进。游离小孢子培养是芸薹属作物最有效的单倍体育种途径,利用小孢子培养技术可以快速获得纯合系,对新品种的选育和种质资源的开发都具有重要的应用价值。小孢子培养技术应用于青花菜最早见于1991年Takahata等[2]的报道,随后张德双等[3]、王春丽[4]等也在青花菜游离小孢子培养上取得了成功。国内很多学者在基因型，培养方式以及再生植株方面进行了研究[5]，但目前青花菜游离小孢子培养技术仍不成熟。本试验以10份不同类型的青花菜为材料，对游离小孢子培养与植株再生进行了研究，旨在完善青花菜小孢子培养技术，同时也为青花菜的遗传育种提供新的材料。
1 试验材料与方法
1.1 供体植株及其生长条件
所用材料为江苏省大学白菜系统生物学实验室提供的10份青花菜，分别为：A57，H&V，A57&A58等。于2013年8月初进行播种育苗，9月中旬分别定植于大学江浦试验田。大田常规管理，经过冬天的低温春化作用，2014年2月底植株便开始开花，在初花期至盛花期期间，选取适宜长度的花蕾进行游离小孢子培养。
1.2 试验用具及试剂
1.2.1 用具
镊子、60×15 mm培养皿、100 ml三角瓶、50 ml三角瓶、研钵与研棒、1000μl移液枪、1ml枪头及枪头盒、T型漏斗、40 μm孔径尼龙网及10 ml离心管，分析天平1台，抽滤装置1台，摇床、离心机、冰箱、高压灭菌锅（TOMYSX500）、光学显微镜（OLYMPUS BX 41）、恒温培养箱（CRYSTAL ISRDV1）等。
1.2.2 试剂
醋酸洋红染液：购买于南京森贝伽生物科技有限公司；
10%活性炭溶液：称取活性炭粉末5 g，溶解于50 mL蒸馏水中，灭菌冷却后4℃保存备用；
配制B5培养基和NLN培养基所需要的各种试剂，配好的B5和NLN培养基贮存于4℃冰箱中，备用。
1.3 试验方法
1.3.1 取样
天气晴朗的上午，选取无病虫害的供体植株的花蕾进行取样，为了减少环境误差，每个基因型至少从3棵植株上进行取样。将花蕾放入盛有少量蒸馏水的小烧杯中，以保持一定的湿度，于4℃冰箱贮存备用。
1.3.2 小孢子发育时期的细胞学观察
青花菜盛花初期分别取1.6~2mm、2~3.0mm、3~4.0mm长度的花蕾进行分离,沉淀物用醋酸洋红染色,在显微镜下观察并计数视野中小孢子发育各个时期的比例，确定蕾长与小孢子所处发育阶段的关系,并观察胚胎发生情况。
1.3.3 镜检
试验前对于取来的每一个基因型的花蕾都要进行镜检。用游标卡尺测量其长度，用以上所述方法进行镜检，确定每一个青花菜基因型的单核靠边期至双核期所对应的花蕾长度的大小。
1.3.4 小孢子的游离和培养
在每次实验之前，提前取样，将样品置于4℃下，预处理24小时。实验时，在样品中采集适宜长度的花蕾，剔除病虫花蕾，放于灭菌的小烧杯中，用75％酒精浸润30s, 1％NaClO溶液消毒10min，再用灭菌蒸馏水冲洗3次，每次3min，然后把花蕾放入灭菌的研钵中，加入B5培养基研磨，用300目滤网过滤于10ml离心管中，1000r/min离心3min，然后倒掉上清液，再加入B5重新悬浮，然后再离心，重复三次，之后用NLN液体培养基重新悬浮，分装到60mm的培养皿中，每皿3ml，最后用封口膜封口。将培养皿置于黑暗中33 ℃热激24h，而后放于25 ℃下黑暗培养。12~15天后待无污染的培养皿中出现用肉眼可见的白色小颗粒时，将其转入60 rpm的摇床震荡暗培养。3周后统计小孢子胚的数目，计算出胚率。出胚率用胚状体数与花蕾数的比值表示。
1.3.5植株再生与移植
将小孢子的再生芽在MS培养基上进行生根培养，形成完整植株，对试管苗进行增殖培养，扩大植株数量，经过炼苗移栽到营养钵中，待植株正常生长后移栽至大田，进行田间管理。
1.4 影响游离小孢子培养胚胎发生因素的研究
1.4.1 基因型
按照以上所述方法，通过对10个基因型的青花菜进行游离小孢子培养，探究基因型对青花菜胚胎发生的影响。每个基因型培养10皿，重复3次。
1.4.2 活性碳浓度
同样以胚胎发生率较高的基因型‘A57’青花菜为供试材料。分别向三个基因型的小孢子悬浮液中加入一定量的10%活性炭溶液，使活性炭的最终浓度为0、0.5、1.0 mg/ml，活性炭浓度为0作为对照，研究活性炭浓度对小孢子胚胎发生率的影响。每个基因型处理10皿，重复3次。
1.4.3 温度胁迫处理
温度胁迫处理包括花蕾低温预处理和小孢子高温热激处理。以胚胎发生较高的基因型‘LBC80’、为供试材料。在花蕾低温预处理的实验中，将花蕾放于盛有少量蒸馏水的小烧杯中放入4℃冰箱，设置0 h、24 h两个处理；在小孢子高温热激处理的实验中，将盛有小孢子悬浮液的培养皿放于培养箱33℃高温热激，设置0 h、24 h两个处理。综合上述，在温度胁迫处理中，共设置了3个处理，分别为：a、4℃ 0 h和33℃ 24 h；b、4℃ 24 h 和 33℃ 24 h；c、4℃ 24 h和33℃ 0 h。探究温度胁迫处理对小孢子胚诱导率的影响，每个基因型处理10皿，重复3次。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 试验材料与方法 2
1.1 供体植株及其生长条件 2
1.2 试验用具及试剂 2
1.2.1 用具 2
1.2.2 试剂 2
1.3 试验方法 2
1.3.1 取样 2
1.3.2 小孢子发育时期的细胞学观察 2
1.3.3 镜检 2
1.3.4 小孢子的游离和培养 2
1.3.5植株再生与移植 3
1.4 影响游离小孢子培养胚胎发生因素的研究 3
1.4.1 基因型 3
1.4.2 活性碳浓度 3
1.4.3 温度胁迫处理 3
1.4.4 数据统计与分析 3
2 结果与分析 3
2.1 小孢子发育时期与花蕾长度的关系 3
2.2 基因型对游离小孢子培养胚胎发生的影响 4
2.3 活性炭浓度对小孢子培养胚胎发生的影响 5
2.4 温度胁迫处理对小孢子培养胚胎发生的影响 5
3 讨论 6
参考文献: 7
青花菜游离小孢子培养及其体系优化
引言
引言：青花菜(Brassica oleracea var. italica)起源于欧洲
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
地中海沿岸,属于十字花科芸薹属[1]。青花菜是一种主要的蔬菜，其营养成分高，还含有吲哚甲醇、B胡萝卜素等物质，是营养保健蔬菜，在国内外都大量种植．我国内地青花菜品种育种的研究起步较晚，育成的优良品种有限，生产上种植的大多数品种从我国台湾或国外引进。游离小孢子培养是芸薹属作物最有效的单倍体育种途径,利用小孢子培养技术可以快速获得纯合系,对新品种的选育和种质资源的开发都具有重要的应用价值。小孢子培养技术应用于青花菜最早见于1991年Takahata等[2]的报道,随后张德双等[3]、王春丽[4]等也在青花菜游离小孢子培养上取得了成功。国内很多学者在基因型，培养方式以及再生植株方面进行了研究[5]，但目前青花菜游离小孢子培养技术仍不成熟。本试验以10份不同类型的青花菜为材料，对游离小孢子培养与植株再生进行了研究，旨在完善青花菜小孢子培养技术，同时也为青花菜的遗传育种提供新的材料。
1 试验材料与方法
1.1 供体植株及其生长条件
所用材料为江苏省大学白菜系统生物学实验室提供的10份青花菜，分别为：A57，H&V，A57&A58等。于2013年8月初进行播种育苗，9月中旬分别定植于大学江浦试验田。大田常规管理，经过冬天的低温春化作用，2014年2月底植株便开始开花，在初花期至盛花期期间，选取适宜长度的花蕾进行游离小孢子培养。
1.2 试验用具及试剂
1.2.1 用具
镊子、60×15 mm培养皿、100 ml三角瓶、50 ml三角瓶、研钵与研棒、1000μl移液枪、1ml枪头及枪头盒、T型漏斗、40 μm孔径尼龙网及10 ml离心管，分析天平1台，抽滤装置1台，摇床、离心机、冰箱、高压灭菌锅（TOMYSX500）、光学显微镜（OLYMPUS BX 41）、恒温培养箱（CRYSTAL ISRDV1）等。
1.2.2 试剂
醋酸洋红染液：购买于南京森贝伽生物科技有限公司；
10%活性炭溶液：称取活性炭粉末5 g，溶解于50 mL蒸馏水中，灭菌冷却后4℃保存备用；
配制B5培养基和NLN培养基所需要的各种试剂，配好的B5和NLN培养基贮存于4℃冰箱中，备用。
1.3 试验方法
1.3.1 取样
天气晴朗的上午，选取无病虫害的供体植株的花蕾进行取样，为了减少环境误差，每个基因型至少从3棵植株上进行取样。将花蕾放入盛有少量蒸馏水的小烧杯中，以保持一定的湿度，于4℃冰箱贮存备用。
1.3.2 小孢子发育时期的细胞学观察
青花菜盛花初期分别取1.6~2mm、2~3.0mm、3~4.0mm长度的花蕾进行分离,沉淀物用醋酸洋红染色,在显微镜下观察并计数视野中小孢子发育各个时期的比例，确定蕾长与小孢子所处发育阶段的关系,并观察胚胎发生情况。
1.3.3 镜检
试验前对于取来的每一个基因型的花蕾都要进行镜检。用游标卡尺测量其长度，用以上所述方法进行镜检，确定每一个青花菜基因型的单核靠边期至双核期所对应的花蕾长度的大小。
1.3.4 小孢子的游离和培养
在每次实验之前，提前取样，将样品置于4℃下，预处理24小时。实验时，在样品中采集适宜长度的花蕾，剔除病虫花蕾，放于灭菌的小烧杯中，用75％酒精浸润30s, 1％NaClO溶液消毒10min，再用灭菌蒸馏水冲洗3次，每次3min，然后把花蕾放入灭菌的研钵中，加入B5培养基研磨，用300目滤网过滤于10ml离心管中，1000r/min离心3min，然后倒掉上清液，再加入B5重新悬浮，然后再离心，重复三次，之后用NLN液体培养基重新悬浮，分装到60mm的培养皿中，每皿3ml，最后用封口膜封口。将培养皿置于黑暗中33 ℃热激24h，而后放于25 ℃下黑暗培养。12~15天后待无污染的培养皿中出现用肉眼可见的白色小颗粒时，将其转入60 rpm的摇床震荡暗培养。3周后统计小孢子胚的数目，计算出胚率。出胚率用胚状体数与花蕾数的比值表示。
1.3.5植株再生与移植
将小孢子的再生芽在MS培养基上进行生根培养，形成完整植株，对试管苗进行增殖培养，扩大植株数量，经过炼苗移栽到营养钵中，待植株正常生长后移栽至大田，进行田间管理。
1.4 影响游离小孢子培养胚胎发生因素的研究
1.4.1 基因型
按照以上所述方法，通过对10个基因型的青花菜进行游离小孢子培养，探究基因型对青花菜胚胎发生的影响。每个基因型培养10皿，重复3次。
1.4.2 活性碳浓度
同样以胚胎发生率较高的基因型‘A57’青花菜为供试材料。分别向三个基因型的小孢子悬浮液中加入一定量的10%活性炭溶液，使活性炭的最终浓度为0、0.5、1.0 mg/ml，活性炭浓度为0作为对照，研究活性炭浓度对小孢子胚胎发生率的影响。每个基因型处理10皿，重复3次。
1.4.3 温度胁迫处理
温度胁迫处理包括花蕾低温预处理和小孢子高温热激处理。以胚胎发生较高的基因型‘LBC80’、为供试材料。在花蕾低温预处理的实验中，将花蕾放于盛有少量蒸馏水的小烧杯中放入4℃冰箱，设置0 h、24 h两个处理；在小孢子高温热激处理的实验中，将盛有小孢子悬浮液的培养皿放于培养箱33℃高温热激，设置0 h、24 h两个处理。综合上述，在温度胁迫处理中，共设置了3个处理，分别为：a、4℃ 0 h和33℃ 24 h；b、4℃ 24 h 和 33℃ 24 h；c、4℃ 24 h和33℃ 0 h。探究温度胁迫处理对小孢子胚诱导率的影响，每个基因型处理10皿，重复3次。
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