内源一氧化氮介导硒抑制小白菜根长生长研究
摘要： 2关键词 2Abstract 2Key words 2引言 21 材料与方法 31.1 试验材料 31.2 实验设计 31.3 指标测定 31.4 统计分析 32 结果与分析 32.1 Na2SeO3处理对小白菜根长生长的影响 42.2 不同浓度Na2SeO3对小白菜根尖内源NO含量影响 42.3 Na2SeO3胁迫下小白菜根内NO与根长的相关性 42.4 外源添加NO抑制剂或清除剂对小白菜根长生长的影响 52.5 外源添加NO抑制剂或清除剂对小白菜根尖内源NO的影响 52.6 外源添加NO对小白菜根长生长的影响 63 讨论 6致谢 7参考文献： 7内源一氧化氮介导硒抑制不结球白菜根伸长的研究园艺 黄贤颖摘要：为研究过量硒对不结球白菜生长的毒害机制，本实验以不结球白菜为材料，通过Na2SeO3处理，添加NO抑制剂和清除剂以及外源添加NO供体比较其根长和根尖内源NO含量，研究了内源NO调控硒抑制不结球白菜根长的生理机制。结果表明：随着Na2SeO3浓度增高，根尖内源NO含量逐渐增加，不结球白菜根长受抑制程度逐渐增强；降低根尖内源NO含量能显著缓解硒对不结球白菜根的抑制作用；外源添加NO供体SNP对不结球白菜根伸长有显著的抑制作用，且Na2SeO3与SNP同时处理对不结球白菜根长的抑制率显著高于单独Na2SeO3或SNP处理。以上结果表明Na2SeO3通过增加不结球白菜根尖内源NO抑制不结球白菜根伸长。
目录
引言
引言
硒是人体和植物必需的微量元素之一。研究发现适量的硒对人体有调节免疫、保护心脑血管系统、抗癌、抗衰老等营养作用[1]。但我国大部分地区硒含量较少，因而我国人口在不同程度上硒摄入量不足，缺硒可能导致克山病、心脏病、甲状腺机能减退，以及免疫能力减弱等症状[2]。因此补硒是保证我们人体健康的重要任务。近年研究实践证明吸收有机硒比吸收无机硒毒性小，较安全，通过动植物将无机硒转化成有机硒具有较大的安全范围，毒副作用小，意义重大。研究发现低浓度的硒可促进高等植物的生长发育，但硒浓度过高会使植物中毒，导致植物生长受到限制，产量下降[3,4]。目前为止研究硒对植物胁迫的具体机制还相当有限，国内外对硒的研究涉及了植物生长，发育，代谢，拮抗重金属毒性以及植物吸收硒的方式，运输方式等多个方面。研究
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发现，低浓度的硒可促进种子萌发[5]，用适宜的硒浓度处理大豆，随着硒浓度的增加其根系活力也会增加[6],适宜浓度的硒也可提高番茄的果实品质[7]。还有研究发现，对被重金属污染的土壤施硒，不仅使植物吸收硒元素，促进作物的生长代谢、提高作物的产量和品质、增强植物的抗氧化性和抗逆性，而且还能缓解重金属对植物的毒害作用[8]。但是过量的硒会影响植物的正常生长，甚至导致死亡。研究表明过量的硒不仅不能缓解非生物胁迫对植物生长的伤害，甚至促进非生物胁迫对植物的损伤。过量施硒不但不能缓解盐胁迫对生菜产量的降低，反而使产量更下降[9]。适量的硒有与重金属拮抗作用，但过量的硒却与重金属毒害有协调作用。硒毒害与生物胁迫的关系方面的研究较少，其相关性目前不太明确。
以上研究结果表明目前植物中的硒胁迫主要集中于对植物生长、基本生理生化指标的研究，但是对硒胁迫的生理机制的研究较少。
NO是普遍存在于自然界的生物活性分子，可减少非生物胁迫下植物体内活性氧ROS的积累，缓解各种胁迫造成的氧化损伤，从而增强植物的适应能力[10]。目前许多研究表明NO对缓解植物重金属中毒有明显作用。王芳等[11]发现，添加外源NO可以缓解铅胁迫对玉米幼苗的伤害。NO可与H2O2和SA相互调节，通过抑制或激活各自信号途径导致基因表达和蛋白水平的改变，参与植物的抗病防御反应[12]。NO可以通过改变活性氧代谢, 降低叶绿素降解等途径来减轻病虫害对植物的伤害[13]。由此可以看出NO在植物对生物或非生物胁迫中都起着重要的做用。NO是否参与植物硒胁迫还需进一步深入研究。
因此本实验试图研究NO在硒毒害植物过程中的作用，为硒胁迫的研究提供新的思路，最终发现高浓度硒对植物毒害作用机理。为现实生产过程中解决植物富硒障碍提供有力的科学依据。
1 材料与方法
试验材料
供试材料：不结球白菜‘五月慢’,购自南京绿领种业有限公司。
供试试剂：亚硒酸钠[sodium selenite，Na2SeO3，Se（IV）]，NO专一清除剂：cPTIO[2（4carboxy2phenyl）4,4,5,5 tetramethylinidazoline1oxyl3oxide]，NO抑制剂: 钨酸钠（sodium Tungstate，Tungstate，Na2WO4），LNMMA（NG甲基L精氨酸），外源NO供体硝普钠（sodium nitroprusside，SNP）[1415]，NO特异性荧光染料DAFFM DA（3Amino，4aminomethyl2’，7’difluorescein，diacetate），Hoagland营养液所需药品均为购自中国国药集团化学试剂有限公司的分析纯，HepesNaOH（pH 7.5) ，蒸馏水。
1.2 实验设计
Na2SeO3处理：利用事先配好的营养液水体培养小白菜幼苗，待幼苗根长长出1 cm时设置对照组（1/2 Hoagland营养液）和分别用5个不同浓度的Na2SeO3（0.03，0.06，0.12，0.23，0.46mM）实验组处理不同时间（0， 6，12，24，48，72 h）。
NO专一清除剂和NO抑制剂处理：在硒抑制中浓度（0.06 mM）的基础上分别添加NO专一清除剂（cPTIO，0.1 mM），NO抑制剂Tungstate（Na2WO4, 30 μM）和LNMMA（NGMonomethylLarginine，200 μM）处理72 h。
外源NO供体硝普钠处理：利用事先配好的营养液水体培养小白菜幼苗，待幼苗根长长出1 cm的对照组和已用0.06 mM实验组中各添加外源NO供体硝普钠（SNP，0.25 mM）处理72 h。
1.3 指标测定
根长测量：将不同处理的根系用蒸馏水漂洗3次后用直尺测量其长度。
荧光检测内源NO含量参考郭凯等[16]的方法，并加以改进。将不通处理的根系浸泡于含有15 μM 的NO特异性荧光染料DAFFM DA（3Amino，4aminomethyl2’，7’difluorescein，diacetate）的20 mM HepesNaOH（pH 7.5）缓冲溶液中。在暗处放置15 min后用后用蒸馏水漂洗3次之后用荧光显微镜（激发光波长 488 nm，发射光 525 nm）观察荧光强度并进行拍照。整个操作过程在避光环境下进行，温度控制在25℃。
1.4 统计分析
每个结果采用3次重复的平均值±标准差表示，采用SPSS 2.0对试验数据进行单因素方差分析（ANOVA），F检验检测不同处理之间在P<0.05水平的差异显著性。
2 结果与分析
2．1 Na2SeO3处理对小白菜根长生长的影响
Na2SeO3对小白菜根部生长的抑制作用呈剂量相关关系。幼苗根部在0，0.03，0.06，0.12，0.23和0.46 mmol/L的Na2SeO3溶液中处理72 h。随着Na2SeO3浓度增加，幼苗根长逐渐变短，0.06 mmol/L Na2SeO3处理组根长与对照组相比，降低了大约50%，0.46 mmol/L时幼苗根部几乎停止生长（图1 A）。后续试验采用半抑制浓度0.06 mmol/L进行研究。在时间梯度试验中，用0.06 mmol/L的Na2SeO3分别处理12，24，36，48，60和72 h后测定根长，结果显示处理组根长从24 h开始受到显著抑制，且差异随时间逐渐变大（图1 B）。
图1 Na2SeO3处理对不结球白菜根长的影响
A：不同浓度Na2SeO3 72 h后对不结球白菜根长的影响；B：0.06 mM Na2SeO3处理1272 h后的根长
目录
引言
引言
硒是人体和植物必需的微量元素之一。研究发现适量的硒对人体有调节免疫、保护心脑血管系统、抗癌、抗衰老等营养作用[1]。但我国大部分地区硒含量较少，因而我国人口在不同程度上硒摄入量不足，缺硒可能导致克山病、心脏病、甲状腺机能减退，以及免疫能力减弱等症状[2]。因此补硒是保证我们人体健康的重要任务。近年研究实践证明吸收有机硒比吸收无机硒毒性小，较安全，通过动植物将无机硒转化成有机硒具有较大的安全范围，毒副作用小，意义重大。研究发现低浓度的硒可促进高等植物的生长发育，但硒浓度过高会使植物中毒，导致植物生长受到限制，产量下降[3,4]。目前为止研究硒对植物胁迫的具体机制还相当有限，国内外对硒的研究涉及了植物生长，发育，代谢，拮抗重金属毒性以及植物吸收硒的方式，运输方式等多个方面。研究
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发现，低浓度的硒可促进种子萌发[5]，用适宜的硒浓度处理大豆，随着硒浓度的增加其根系活力也会增加[6],适宜浓度的硒也可提高番茄的果实品质[7]。还有研究发现，对被重金属污染的土壤施硒，不仅使植物吸收硒元素，促进作物的生长代谢、提高作物的产量和品质、增强植物的抗氧化性和抗逆性，而且还能缓解重金属对植物的毒害作用[8]。但是过量的硒会影响植物的正常生长，甚至导致死亡。研究表明过量的硒不仅不能缓解非生物胁迫对植物生长的伤害，甚至促进非生物胁迫对植物的损伤。过量施硒不但不能缓解盐胁迫对生菜产量的降低，反而使产量更下降[9]。适量的硒有与重金属拮抗作用，但过量的硒却与重金属毒害有协调作用。硒毒害与生物胁迫的关系方面的研究较少，其相关性目前不太明确。
以上研究结果表明目前植物中的硒胁迫主要集中于对植物生长、基本生理生化指标的研究，但是对硒胁迫的生理机制的研究较少。
NO是普遍存在于自然界的生物活性分子，可减少非生物胁迫下植物体内活性氧ROS的积累，缓解各种胁迫造成的氧化损伤，从而增强植物的适应能力[10]。目前许多研究表明NO对缓解植物重金属中毒有明显作用。王芳等[11]发现，添加外源NO可以缓解铅胁迫对玉米幼苗的伤害。NO可与H2O2和SA相互调节，通过抑制或激活各自信号途径导致基因表达和蛋白水平的改变，参与植物的抗病防御反应[12]。NO可以通过改变活性氧代谢, 降低叶绿素降解等途径来减轻病虫害对植物的伤害[13]。由此可以看出NO在植物对生物或非生物胁迫中都起着重要的做用。NO是否参与植物硒胁迫还需进一步深入研究。
因此本实验试图研究NO在硒毒害植物过程中的作用，为硒胁迫的研究提供新的思路，最终发现高浓度硒对植物毒害作用机理。为现实生产过程中解决植物富硒障碍提供有力的科学依据。
1 材料与方法
试验材料
供试材料：不结球白菜‘五月慢’,购自南京绿领种业有限公司。
供试试剂：亚硒酸钠[sodium selenite，Na2SeO3，Se（IV）]，NO专一清除剂：cPTIO[2（4carboxy2phenyl）4,4,5,5 tetramethylinidazoline1oxyl3oxide]，NO抑制剂: 钨酸钠（sodium Tungstate，Tungstate，Na2WO4），LNMMA（NG甲基L精氨酸），外源NO供体硝普钠（sodium nitroprusside，SNP）[1415]，NO特异性荧光染料DAFFM DA（3Amino，4aminomethyl2’，7’difluorescein，diacetate），Hoagland营养液所需药品均为购自中国国药集团化学试剂有限公司的分析纯，HepesNaOH（pH 7.5) ，蒸馏水。
1.2 实验设计
Na2SeO3处理：利用事先配好的营养液水体培养小白菜幼苗，待幼苗根长长出1 cm时设置对照组（1/2 Hoagland营养液）和分别用5个不同浓度的Na2SeO3（0.03，0.06，0.12，0.23，0.46mM）实验组处理不同时间（0， 6，12，24，48，72 h）。
NO专一清除剂和NO抑制剂处理：在硒抑制中浓度（0.06 mM）的基础上分别添加NO专一清除剂（cPTIO，0.1 mM），NO抑制剂Tungstate（Na2WO4, 30 μM）和LNMMA（NGMonomethylLarginine，200 μM）处理72 h。
外源NO供体硝普钠处理：利用事先配好的营养液水体培养小白菜幼苗，待幼苗根长长出1 cm的对照组和已用0.06 mM实验组中各添加外源NO供体硝普钠（SNP，0.25 mM）处理72 h。
1.3 指标测定
根长测量：将不同处理的根系用蒸馏水漂洗3次后用直尺测量其长度。
荧光检测内源NO含量参考郭凯等[16]的方法，并加以改进。将不通处理的根系浸泡于含有15 μM 的NO特异性荧光染料DAFFM DA（3Amino，4aminomethyl2’，7’difluorescein，diacetate）的20 mM HepesNaOH（pH 7.5）缓冲溶液中。在暗处放置15 min后用后用蒸馏水漂洗3次之后用荧光显微镜（激发光波长 488 nm，发射光 525 nm）观察荧光强度并进行拍照。整个操作过程在避光环境下进行，温度控制在25℃。
1.4 统计分析
每个结果采用3次重复的平均值±标准差表示，采用SPSS 2.0对试验数据进行单因素方差分析（ANOVA），F检验检测不同处理之间在P<0.05水平的差异显著性。
2 结果与分析
2．1 Na2SeO3处理对小白菜根长生长的影响
Na2SeO3对小白菜根部生长的抑制作用呈剂量相关关系。幼苗根部在0，0.03，0.06，0.12，0.23和0.46 mmol/L的Na2SeO3溶液中处理72 h。随着Na2SeO3浓度增加，幼苗根长逐渐变短，0.06 mmol/L Na2SeO3处理组根长与对照组相比，降低了大约50%，0.46 mmol/L时幼苗根部几乎停止生长（图1 A）。后续试验采用半抑制浓度0.06 mmol/L进行研究。在时间梯度试验中，用0.06 mmol/L的Na2SeO3分别处理12，24，36，48，60和72 h后测定根长，结果显示处理组根长从24 h开始受到显著抑制，且差异随时间逐渐变大（图1 B）。
图1 Na2SeO3处理对不结球白菜根长的影响
A：不同浓度Na2SeO3 72 h后对不结球白菜根长的影响；B：0.06 mM Na2SeO3处理1272 h后的根长
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