荷花实时定量pcr分析中内参基因的选择
摘要：实时荧光定量PCR（qRT-PCR）是目前研究基因定量表达的重要方法，根据特定实验材料及条件选择qRT-PCR分析中合适的内参基因对于准确校正目的基因的表达至关重要。本研究以荷花（Nelumbo nucifera）不同组织（根、茎、叶、叶柄和花瓣）为材料，利用qRT-PCR技术探讨了12个候选内参基因：eEF1a、LUG、GAPDH、PGK、CUL、FPGS、eIF4A、ACTB、TUA、ANX、TRYa及HPRT的表达情况，并利用geNorm, NormFinder和BestKeeper三个软件分别对其表达稳定性进行了比较。综合分析结果显示：在荷花不同组织中，LUG和eEF1a表达最稳定。因此，在不同组织取样中使用LUG和eEF1a两个表达最稳定的基因组合作为内参，即可获得更为精确的目的基因的表达结果。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1 材料与方法3
1.1 材料 3
1.2 方法 3
1.2.1 提取总RNA 和合成cDNA第一链3
1.2.2 内参基因的选择及特异性引物的设计3
1.2.3 内参基因目的片段的普通PCR扩增3
1.2.4 内参基因的qRTPCR分析3
1.2.5 数据处理与分析4
2 结果与分析4
2.1 总RNA质量检测4
2.2 内参基因目的片段的普通PCR扩增4
2.3 内参基因的qRTPCR分析4
2.4 内参基因的表达稳定性分析5
2.4.1 geNorm分析5
2.4.2 NormFinder分析6
2.4.3 BestKeeper分析6
2.4.4 综合分析7
3 讨论 7
致谢8
参考文献8
荷花实时定量PCR分析中内参基因的选择
引言
引言 实时定量PCR（Realtime quantitative PCR，qRTPCR）是目前研究基因表达的
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
重要方法，它将荧光染料或带有荧光标记的探针引入PCR反应体系，利用荧光定量PCR仪实时监测反应过程中荧光信号的累积量，最后通过Ct值与标准曲线分析确定目的基因的表达量（桑健，2014）。与传统的基因表达定量分析技术相比，qRTPCR具有重复性好、快速高效、灵敏度高、特异性强、操作简单、低样品需求量及检测范围广等优点（刘洪峰等，2015）。因此，近年来被广泛地应用于植物分子生物学研究。也正是这些优点使得它一方面对RNA的质量以及反转录效率有较高要求，另一方面对引物的特异性、扩增效率以及内参基因的选择等要求严格（曾文韬等，2015）。
理想的内参基因的表达只受启动子序列或启动子与RNA聚合酶相互作用的影响，而不受其他机制调节，且其稳定的表达水平与目的基因的表达水平相近（张芳明，2013）。也就是说，在不同组织或细胞中、不同生长发育时期、不同实验处理条件下，理想的内参基因的表达水平无显著的差异（桑健，2014；刘洪峰，2015）。在植物qRTPCR研究中，通常选择组成性表达的看家基因作为内参基因使用，主要包括α/β微管蛋白基因（TUA/TUB）、肌动蛋白基因（ACT）、转录延伸因子基因（eEF1a）、甘油醛－3－磷酸甘油醛脱氢酶基因（GAPDH）、18S核糖体RNA（18S rRNA）、多聚泛素酶基因（UBQ）、泛素连接酶基因（UBI）、亲环蛋白基因（CYP）和组蛋白基因（H2A）等。这些基因或是生物体维持正常生命活动所必需的细胞器骨架的基本组成成分，或参与生物体基本生化代谢，因此，理论上它们能在不同细胞或生理状态下稳定地表达（曾文韬，2015）。但对拟南芥、水稻、大豆、番茄和土豆等的研究结果表明，持家基因的表达并非恒定的，因此其作为qRTPCR的内参基因的功能受到了挑战（Gutierrez et al., 2008; Jain et al., 2006; Jain et al., 2008; Lovdal and Lillo, 2009; Nicot et al., 2005;）。若选择不合适的内参基因对目的基因的表达量进行归一化分析，将会影响实验结果的准确性，且可能导致不同实验的研究结果无法平行比对（张慧琴等，2015）。因此，根据实验处理及不同材料来选择内参基因很重要，促使筛选稳定的内参基因成为研究热点。目前, 常用的内参基因评估方法是应用软件对qRTPCR的Ct值进行综合分析（姜婷等，2015），基于Excel界面的geNorm、NormFinder和 BestKeeper常用于内参基因筛选，通过对候选基因在若干样品中的表达差异进行评估，选择出在相应实验条件下能够稳定表达的内参基因（桑健，2014）。
荷花（Nelumbo nucifera）为莲科莲属植物，集食用、药用和观赏于一身。其各组织均可入药：莲梗通气宽胸；荷叶清热解暑；花瓣治暑热烦渴；莲房消淤止血；莲子健脾止泻：莲芯清火安神；藕节还有解酒的功效。近年来研究发现：其各组织提取物中含丰富的生物活性成分，主要有生物碱、类黄酮、苷类化合物、三萜化合物、维生素以及多种矿物质。体内和体外实验证明这些生物活性成分具有抗氧化、消炎杀菌、稳定心律、退热、降血压、免疫调节等功效，可用于治疗糖尿病、腹泻、贫血等（Mukherjee et al., 2009; Bo et al., 2010）。此外，荷花是中国的十大名花之一，花大且色艳，清香，适应性极强，可广植湖泊，用于河道管理，水域绿化，净化水质，修复湿地，保护生态，成为天然景观，还可用于园林造景或盆栽瓶插，因此具有广泛的应用价值和较高的观赏价值。
荷花多方面的经济价值使它得到越来越多学者的关注，早期的研究主要集中在荷花的发育过程和生理学，如花托的光合作用（Miller, et al, 2009）、荷花的花粉发育及授粉过程（Li and Huang, 2009）等。随着生物技术的发展，近年来荷花分子生物学方面的研究也逐渐成为热点。Ming等（2013）及Wang等（2013）先后公布了荷花的基因组信息，其基因组大小约为929Mb，而后Wang等（2015）构建了荷花的基因组注释、转录组以及分子标记等信息比较全面的网站（http://lotusdb.wbgcas.cn），这些研究成果为荷花的功能基因组学和分子育种等方面的研究提供了很好的平台。荷花的花蕾cDNA文库也已构建完成，为荷花花蕾期转录组数据的开发及其花器官发育相关基因的功能分析奠定了基础（吴璇等，2016）。qRTPCR技术也越来越成为荷花基因研究与分子育种的重要技术手段：张阿慧等（2015）利用qRTPCR技术发现，一定浓度的镉胁迫可诱导荷花NnγGCS基因的表达；刘艺平等（2014）采用qRTPCR技术发现LFY基因在荷花幼叶期、花蕾期及盛花期的根、茎、叶和花中均有表达，且在花蕾期的表达量较高。但相关研究并未对荷花中内参基因的稳定性进行系统评定，因此研究结果可能存在一定的误差。为了确保荷花qRTPCR分析中关键基因表达水平的准确性，本研究以荷花不同组织（根、茎、叶、叶柄和花瓣）为材料，利用qRTPCR技术探讨了12个候选内参基因：eEF1a、LUG、GAPDH、PGK、CUL、FPGS、eIF4A、ACTB、TUA、ANX、TRYa及HPRT的表达水平，并利用geNorm、NormFinder和BestKeeper程序对各候选内参基因基因稳定性进行评价，以期筛选出在荷花不同组织中都稳定的内参基因。本研究的预期结果可为有关荷花中关键基因的表达水平方面的研究提供更加全面的参考和校正依据，具有一定的的实用价值。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1 材料与方法3
1.1 材料 3
1.2 方法 3
1.2.1 提取总RNA 和合成cDNA第一链3
1.2.2 内参基因的选择及特异性引物的设计3
1.2.3 内参基因目的片段的普通PCR扩增3
1.2.4 内参基因的qRTPCR分析3
1.2.5 数据处理与分析4
2 结果与分析4
2.1 总RNA质量检测4
2.2 内参基因目的片段的普通PCR扩增4
2.3 内参基因的qRTPCR分析4
2.4 内参基因的表达稳定性分析5
2.4.1 geNorm分析5
2.4.2 NormFinder分析6
2.4.3 BestKeeper分析6
2.4.4 综合分析7
3 讨论 7
致谢8
参考文献8
荷花实时定量PCR分析中内参基因的选择
引言
引言 实时定量PCR（Realtime quantitative PCR，qRTPCR）是目前研究基因表达的
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
重要方法，它将荧光染料或带有荧光标记的探针引入PCR反应体系，利用荧光定量PCR仪实时监测反应过程中荧光信号的累积量，最后通过Ct值与标准曲线分析确定目的基因的表达量（桑健，2014）。与传统的基因表达定量分析技术相比，qRTPCR具有重复性好、快速高效、灵敏度高、特异性强、操作简单、低样品需求量及检测范围广等优点（刘洪峰等，2015）。因此，近年来被广泛地应用于植物分子生物学研究。也正是这些优点使得它一方面对RNA的质量以及反转录效率有较高要求，另一方面对引物的特异性、扩增效率以及内参基因的选择等要求严格（曾文韬等，2015）。
理想的内参基因的表达只受启动子序列或启动子与RNA聚合酶相互作用的影响，而不受其他机制调节，且其稳定的表达水平与目的基因的表达水平相近（张芳明，2013）。也就是说，在不同组织或细胞中、不同生长发育时期、不同实验处理条件下，理想的内参基因的表达水平无显著的差异（桑健，2014；刘洪峰，2015）。在植物qRTPCR研究中，通常选择组成性表达的看家基因作为内参基因使用，主要包括α/β微管蛋白基因（TUA/TUB）、肌动蛋白基因（ACT）、转录延伸因子基因（eEF1a）、甘油醛－3－磷酸甘油醛脱氢酶基因（GAPDH）、18S核糖体RNA（18S rRNA）、多聚泛素酶基因（UBQ）、泛素连接酶基因（UBI）、亲环蛋白基因（CYP）和组蛋白基因（H2A）等。这些基因或是生物体维持正常生命活动所必需的细胞器骨架的基本组成成分，或参与生物体基本生化代谢，因此，理论上它们能在不同细胞或生理状态下稳定地表达（曾文韬，2015）。但对拟南芥、水稻、大豆、番茄和土豆等的研究结果表明，持家基因的表达并非恒定的，因此其作为qRTPCR的内参基因的功能受到了挑战（Gutierrez et al., 2008; Jain et al., 2006; Jain et al., 2008; Lovdal and Lillo, 2009; Nicot et al., 2005;）。若选择不合适的内参基因对目的基因的表达量进行归一化分析，将会影响实验结果的准确性，且可能导致不同实验的研究结果无法平行比对（张慧琴等，2015）。因此，根据实验处理及不同材料来选择内参基因很重要，促使筛选稳定的内参基因成为研究热点。目前, 常用的内参基因评估方法是应用软件对qRTPCR的Ct值进行综合分析（姜婷等，2015），基于Excel界面的geNorm、NormFinder和 BestKeeper常用于内参基因筛选，通过对候选基因在若干样品中的表达差异进行评估，选择出在相应实验条件下能够稳定表达的内参基因（桑健，2014）。
荷花（Nelumbo nucifera）为莲科莲属植物，集食用、药用和观赏于一身。其各组织均可入药：莲梗通气宽胸；荷叶清热解暑；花瓣治暑热烦渴；莲房消淤止血；莲子健脾止泻：莲芯清火安神；藕节还有解酒的功效。近年来研究发现：其各组织提取物中含丰富的生物活性成分，主要有生物碱、类黄酮、苷类化合物、三萜化合物、维生素以及多种矿物质。体内和体外实验证明这些生物活性成分具有抗氧化、消炎杀菌、稳定心律、退热、降血压、免疫调节等功效，可用于治疗糖尿病、腹泻、贫血等（Mukherjee et al., 2009; Bo et al., 2010）。此外，荷花是中国的十大名花之一，花大且色艳，清香，适应性极强，可广植湖泊，用于河道管理，水域绿化，净化水质，修复湿地，保护生态，成为天然景观，还可用于园林造景或盆栽瓶插，因此具有广泛的应用价值和较高的观赏价值。
荷花多方面的经济价值使它得到越来越多学者的关注，早期的研究主要集中在荷花的发育过程和生理学，如花托的光合作用（Miller, et al, 2009）、荷花的花粉发育及授粉过程（Li and Huang, 2009）等。随着生物技术的发展，近年来荷花分子生物学方面的研究也逐渐成为热点。Ming等（2013）及Wang等（2013）先后公布了荷花的基因组信息，其基因组大小约为929Mb，而后Wang等（2015）构建了荷花的基因组注释、转录组以及分子标记等信息比较全面的网站（http://lotusdb.wbgcas.cn），这些研究成果为荷花的功能基因组学和分子育种等方面的研究提供了很好的平台。荷花的花蕾cDNA文库也已构建完成，为荷花花蕾期转录组数据的开发及其花器官发育相关基因的功能分析奠定了基础（吴璇等，2016）。qRTPCR技术也越来越成为荷花基因研究与分子育种的重要技术手段：张阿慧等（2015）利用qRTPCR技术发现，一定浓度的镉胁迫可诱导荷花NnγGCS基因的表达；刘艺平等（2014）采用qRTPCR技术发现LFY基因在荷花幼叶期、花蕾期及盛花期的根、茎、叶和花中均有表达，且在花蕾期的表达量较高。但相关研究并未对荷花中内参基因的稳定性进行系统评定，因此研究结果可能存在一定的误差。为了确保荷花qRTPCR分析中关键基因表达水平的准确性，本研究以荷花不同组织（根、茎、叶、叶柄和花瓣）为材料，利用qRTPCR技术探讨了12个候选内参基因：eEF1a、LUG、GAPDH、PGK、CUL、FPGS、eIF4A、ACTB、TUA、ANX、TRYa及HPRT的表达水平，并利用geNorm、NormFinder和BestKeeper程序对各候选内参基因基因稳定性进行评价，以期筛选出在荷花不同组织中都稳定的内参基因。本研究的预期结果可为有关荷花中关键基因的表达水平方面的研究提供更加全面的参考和校正依据，具有一定的的实用价值。
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